이 방법은 적응성 면역 반응의 역할과 이 다인자 질환의 병신과 같은 결핵 분야에서 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 핵산 염기 방법의 주요 장점은 세균부하와 유전자 발현 수준 모두 동일한 개인으로부터 측정될 수 있다는 것이다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 7H10 플레이트의 문화 M.marinum을 시작합니다.
ADC 농축, 폴리소르바테 80 및 글리세롤을 함유한 7H9 배지의 10밀리리터를 세포 배양 플라스크로 이송한다. 그런 다음, 멸균 1개의 미세리터 접종 루프를 사용하여 M.marinum 세균 질량의 1루프를 플라스크로 무균적으로 전달한다. 캡을 느슨하게 두거나 필터 캡을 사용하여 OD600이 약 0.7에 도달할 때까지 3~4일 동안 흔들리지 않고 어둠 속에서 섭씨 29도에서 충분한 가스 교환 및 배양을 허용합니다.
희석 하고 텍스트에 설명 된 대로 박테리아를 배양 계속. 감염을 위한 세균용 용액을 준비하기 시작하려면 배양의 1 밀리리터를 신선한 튜브로 옮긴다. 원심 분리기 는 10, 000g에서 3 분 동안.
상체를 제거하고 멸균 PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 분리하십시오. 페놀 레드의 밀리리터당 0.3 밀리그램을 사용하여, 원하는 세균 농도에 도달하기 위해 현탁액을 희석시킵니다. 그 후, 1밀리리터 주사기를 사용하여 27 게이지 바늘을 세 번 통해 서스펜션을 천천히 당깁니다.
각 aliquot에 사용하기 직전에 이 단계를 수행합니다. 첫째, 희석된 세균용 용액의 5개의 마이크로리터 액액을 파라핀 필름에 피펫합니다. 그런 다음, 30 게이지 인슐린 바늘로 물방울을 당깁니다.
5개월에서 8개월 된 물고기를 야생식 물고기이고 다른 하나는 헝겊 돌연변이 물고기인 물고기를 실험에 사용하십시오. 촉촉한 거품 플라스틱 조각의 슬릿에이 물고기 복부 측면을 배치합니다. 45도 각도에서 골반 지느러미 사이에 인슐린 바늘을 주입하십시오.
전체 개구부가 복강 내부에 있는지 확인하기 위해 바늘을 위쪽으로 열어 두십시오. 그런 다음 세균용 용액을 천천히 주입합니다. 그 후, 조심스럽게 바늘을 제거하고 즉시 신선한 탱크 물로 가득 복구 탱크로 물고기를 전송합니다.
7H10 플레이트에서 15분마다 사용시 세균 성 액수의 샘플을 채취하십시오. 감염 복용량을 확인 하려면 5 일 동안 섭씨 29도에서 이러한 샘플을 배양. 정기적으로 물고기의 웰빙을 확인, 3-aminobenzoic 산 에틸 에스테르의 0.02 % 이상으로 물에 배양하여 감염 증상으로 어떤 물고기를 안락사확인.
물고기를 안락사한 후, 분기 광선에 핀 후방을 삽입합니다. 두 번째 핀을 꼬리를 통해 삽입하여 물고기를 플랫폼에 대치합니다. 메스를 사용하여 복강 전체를 엽니다.
그런 다음, 작은 숟가락과 날카로운 끝 핀셋을 사용하여 심장에서 시작하여 꼬리쪽으로 척추를 따라 작업하여 모든 내부 장기를 한 블록에 분리합니다. 핀셋을 사용하여 클로카에서 장그물을 분리하고 장기를 1.5 밀리리터 균질화 튜브로 옮기면 2.8mm 세라믹 구슬반이 들어 있습니다. 즉시 샘플을 동결건조 얼음에 튜브를 배치합니다.
균질화 할 준비가 될 때까지 음의 섭씨 80도에 샘플을 저장합니다. DNA와 RNA를 추출한 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 정량적 PCR에 의해 진균 하중을 측정합니다. 이 연구에서, 성인 얼룩말 물고기는 관면 주사에 의해 M.marinum에 감염.
높은 감염 복용량은 평균 하중이 궁극적으로 물고기를 죽이는 약 5백만 박테리아에 도달할 때까지 진균 하중이 계속 증가하는 진보적인 질병으로 이끌어 내는 것을 보입니다. 반면에 낮은 복용량은 진보적 인, 잠재, 재활성화 및 살균 된 감염으로 인간 결핵에서 볼 수있는 것과 유사한 질병 스펙트럼의 발달로 이어집니다. 이 경우, 질병이 물고기의 대다수에 있는 꾸준한 상태에 도달하는 후에 4 주 동안 부하가 계속 증가하고 있습니다.
이 데이터는 물고기를 감염시키기 위하여 이용된 진균의 초기 수가 감염의 결과에 대한 중요한 결정요인이다는 것을 밝힙니다. 래그 돌연변이 얼룩말물고기는 균균의 성장을 충분히 제한할 수 없는 것으로 보이며, 이로 인해 세균부하가 증가하고 이환율이 증가합니다. 이것은 명확하게 진균 감염을 통제에 적응 면제의 중요성을 보여줍니다.
인터류신-4의 수준은 인터류신-4의 효율적인 도입을 위해 적응 반응이 필요하지만, 진균감염 후 인터페론 감마의 도입을 위해 분배할 수 있음을 밝히는 야생형 그룹에서 상당히 높다. 이 프로토콜은 동일한 샘플에서 DNA와 RNA를 모두 수집하여 샘플의 진균 부담을 숙주 및 박테리아 모두의 유전자 발현 데이터와 결합할 수 있게 합니다. 이 기술은 진균 하중 및 면역 반응에 미치는 영향을 평가하기 위해 약물 또는 백신 후보자의 투여와 결합 될 수 있습니다.
이 절차를 시도하는 동안, 생물 안전 수준 2 병원균과 함께 작업 할 때 개인 안전 및 폐기물 처리에 대한 지역 지침을 준수하는 것이 중요합니다. 이 기술은 생체 내 윤리적 비 포유류인 제브라피시에 휴면 균균으로 활성 및 잠복 결핵을 모두 연구할 수 있게 합니다.
