利用超滤离心技术分离小鼠支气管肺泡灌洗液中的细胞外囊

此方法可以帮助解决与使用超滤离心法衍生的支气管离泡液的效率、回收率和纯度有关的问题。我们直接将该技术与超离心和密度梯度纯化技术进行比较。该技术的主要优点是简单、高效，适用于小体积样品，如穆林支气管洗液。

更重要的是，与超离心隔离方法相比，它可提供高纯度和更高的可扩展性。演示这个程序的将是诺曼·加勒特三世先生，我实验室的副研究员。首先，将22测表血管导管插入安乐死小鼠的气管。

将胰岛素注射器与一毫升冰冷无菌 DPBS 连接，将一毫升注入两个肺。慢慢提取注射器柱塞，以检索支气管洗液或BAL液体。将BAL液体放入冰上锥形管中。

之后，从25只小鼠中拉出BAL流体，将其分成两组相等。在4摄氏度下将BAL流体在400倍G下离心5分钟。收集上一代，在4摄氏度下以15000倍G离心10分钟。

然后收集上一液，并立即执行 EV 隔离步骤。首先，通过0.2微米无菌注射器过滤器过滤超级纳兰特。在此之后，用无菌 DPBS 将离心过滤单元平衡 10 分钟。

然后在摄氏4度下将离心装置在15，000倍G下离心10分钟。用 15 毫升 BAL 液体填充过滤器。在3000G下离心30分钟，温度为4摄氏度。

在此之后，通过反复轻轻移液，用14毫升无菌DMB洗涤。在4摄氏度的3000 G下将过滤装置离心30分钟，取出DPBS并浓缩了止动物。要收集浓缩的BAL流体衍生EV，请将移液器插入过滤单元的底部，并使用侧扫侧扫除运动提取样品。

然后，将BAL流体衍生出EV，并将其储存在零下80摄氏度。或者，从将之前获得的上一个上一个液位转移到超离心管开始。在摄氏4度时，在1万G下离心30分钟。

然后收集上一代和离心机。丢弃上一级，在 DPBS 的 200 微升中重新悬浮 EV 颗粒。在此之后，将 EV 悬架与 300 微升 50%碘素醇工作溶液混合。

并转移到15毫升的超离心管。然后根据文本协议添加缓冲液，以创建浮力密度梯度，并在 100，000 G 下将其离心 3 小时 50 分钟。收集 15% 和 25% 的碘糖醇馏分，并在 DPBS 中稀释它们，使体积达到 15 毫升。

将分数转移到一个新的超离心管中，并在摄氏4度的10万G下离心60分钟。丢弃上一杯，在 50 微升无菌 DPBS 中重新悬浮 EV 颗粒。要开始纳米颗粒跟踪分析，请将EV样品稀释在一毫升的DPBS中。

将样品装入胰岛素注射器。在此之后，将注射器连接到注射器泵，并测量颗粒数和大小。将摄像机级别设置为 14，将检测阈值设置为 1。

接下来，使用板读卡器通过色度检测量化EV样品中的蛋白质含量。用印迹加载缓冲液和DTT溶解每个样品中等量的EV蛋白。然后在70摄氏度加热样品10分钟。

将样品装入双流加丙烯酰胺凝胶中，并运行电泳35分钟。然后使用干转法将蛋白质转移到硝基纤维素膜上。在此之后，用5%的脱脂牛奶阻断膜60分钟，轻轻摇动。

在四摄氏度下用EV表面蛋白标记的抗体孵育膜，并温和摇动过夜。在室温下用HRP链接抗体孵育膜60分钟，形成膜。用TBST缓冲液清洗膜10分钟三次。

最后，在进行成像之前，利用化学发光HRP抗体检测试剂开发膜。为了开始流动细胞学，在49微升PEB染色缓冲液中稀释BAL流体衍生EV。然后在每个样品中加入三个抗体，然后在黑暗中摇动60分钟，在4摄氏度下孵育样品。

最后，用40微升膜过滤PEB染色缓冲液稀释样品，进行流式细胞测定分析。在此协议中，EV 使用 UFC 和 UC-DGC 方法与小鼠 BAL 流体隔离。与 UC-DGC-EV 的尺寸和均匀尺寸分布不同，从 UFC 方法分离出的从正常小鼠中提取的 EV 的 BAL 流体显示尺寸更小、尺寸更均匀。

与 UC-DGC 技术相比，UFC 技术的总粒子计数也显著增加。以UFC-EV毫克为单位的蛋白质总回收率也高于UC-DGC-EV，表明UFC技术更加时间和精力高效。最后，通过流式细胞仪对BAL流体衍生EV进行进一步描述。

UFC-EV 和 UC-DGC-EV 均表示 CD63、CD9 和 CD81。在尝试此过程时，重要的是要记住用 DPBS 对超滤单元膜进行补水。一旦膜被水合，装置需要保持湿润，直到使用。

从过滤单元中检索细胞外囊泡节可能具有挑战性。确保移液器尖端被一边扫到一边，以便从过滤器单元中恢复大部分 EV。该技术开发后，为细胞外囊泡分离领域的研究人员探索小动物正常或病理条件下发泡体外囊体的生物功能铺平了道路。