이 방법은 초여유 원심분리 접근법을 사용하여 세포외 소포 유래 기관지포 용암체의 효율성, 회수 수율 및 순도와 관련된 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 직접 초원심분리 및 밀도 그라데이션 정화 기술에이 기술을 비교했다. 이 기술의 주요 장점은 머린 기관지 알포라 라베액과 같은 소량 샘플에 간단하고 효율적이며 적합하다는 것입니다.
더 중요한 것은 초원심분리 방법에 비해 높은 순도와 확장성을 제공한다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 동료 인 노먼 개렛 III (Norman Garrett III)가 될 것입니다. 시작하려면 안락사 된 마우스의 기관에 22 게이지 협경화를 삽입하십시오.
인슐린 주사기를 얼음 냉멸 균 DPBS 1 밀리리터로 부착하고 두 폐에 1 밀리리터를 주입합니다. 기관지알포라 라베액 또는 BAL 유체를 회수하기 위해 주사기 플런저를 천천히 철회합니다. 그리고 BAL 유체를 얼음의 원물 튜브에 분배합니다.
그 후, 25마리의 마우스에서 BAL 액을 끌어내어 두 개의 동일한 세트로 나눕니다. 발 유체를 섭씨 4도에서 5분간 400배 G로 원심분리합니다. 10 분 동안 섭씨 4도에서 15, 000 배 G에서 상체및 원심 분리기를 수집합니다.
그런 다음 상체를 수집하고 즉시 EV 격리 단계로 진행합니다. 먼저 0.2 마이크로미터 멸균 주사기 필터를 통해 슈퍼 나탄을 필터링합니다. 그 후, 10 분 동안 멸균 DPBS와 원심 필터 장치를 평형.
그런 다음 원심 유닛을 섭씨 4도에서 10분 동안 15, 000배 G에서 원심 장치를 원심분리합니다. 15 밀리리터의 BAL 유체로 필터를 채웁니다. 그리고 원심 분리는 섭씨 4도에서 30 분 동안 3, 000 G의 3, 000 G에서 분리됩니다.
그 후, 반복적으로 부드럽게 파이펫을 하여 멸균 DPBS의 14 밀리리터로 보용을 씻으십시오. 3, 000 G의 필터 유닛을 섭씨 4도에서 30분 동안 원심분리하여 DPBS를 제거하고 보기를 농축합니다. 농축 BAL 유체 유래 EV를 수집하려면, 필터 장치의 바닥에 피프터를 삽입하고, 측면 스위핑 모션을 사용하여 샘플을 철회한다.
그런 다음 BAL 유체파생 EV를 알리쿼트와 섭씨 영하 80도에 저장합니다. 또는, 초원심분리기 튜브에 이전 이전하여 시작합니다. 그리고 원심 분리는 섭씨 4도에서 30 분 동안 10, 000 G의.
그런 다음 상체와 원심 분리기를 수집합니다. 상체를 폐기하고 DPBS의 200 마이크로 리터에서 EV 펠릿을 다시 중단하십시오. 그 후 EV 서스펜션을 50%의 iodixanol 작동 솔루션300 마이크로리터와 혼합합니다.
그리고 15 밀리리터 초원심분리기 튜브로 옮김합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 버퍼 솔루션을 추가하여 부력 밀도 그라데이션을 만들고 원심분리기를 100, 000 G에서 3시간 50분 동안 만듭니다. 15%와 25%의 iodixanol 분획을 수집하고 DPBS에서 희석하여 최대 15밀리리터의 부피를 가져옵니다.
분획을 새로운 초원심분리기 튜브와 원심분리기100, 000 G의 섭씨 4도에서 60분간 전송합니다. 상체를 버리고 멸균 DPBS의 50 마이크로 리터에서 EV 펠릿을 다시 중단하십시오. 나노 입자 추적 분석을 시작하려면 EV 샘플을 DPBS의 1 밀리리터로 희석하십시오.
그리고 인슐린 주사기에 샘플을로드합니다. 그 후 주사기 펌프에 주사기를 부착하고 파티클 수와 크기를 측정합니다. 카메라 레벨을 14로 설정하고 감지 임계값을 하나로 설정합니다.
다음으로, 플레이트 판독기를 사용하여 색탐지를 통해 EV 샘플의 단백질 양을 정량화한다. 블로팅 로딩 버퍼 및 DTT를 사용하여 각 샘플에서 동일한 양의 EV 단백질을 용해합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 70도에서 10분 동안 가열합니다.
샘플을 비스 트리스 플러스 아크릴아미드 젤에 적재하고 전기 전도를 35분 동안 실행합니다. 그런 다음 건조 전달 방법을 사용하여 니트로 셀룰로오스 막으로 단백질을 전달합니다. 그 후, 부드러운 흔들림으로 60 분 동안 5 % 탈지 우유로 멤브레인을 차단하십시오.
밤새 부드러운 흔들림과 함께 섭씨 4도에서 EV 표면 단백질 마커에 항체로 멤브레인을 배양하십시오. 실온에서 60분 동안 HRP 링크 항체로 멤브레인을 배양하여 멤브레인을 개발한다. TBST 버퍼로 멤브레인을 3번 세척합니다.
마지막으로, 화상 진찰을 진행하기 전에 화학 발광 HRP 항체 검출 시약으로 막을 개발하십시오. 유동 세포측정을 시작하려면 BAL 유체 파생 EV를 PEB 염색 버퍼 49마이크로리터로 희석합니다. 그런 다음 각 샘플에 3개의 항체를 추가하고, 어둠 속에서 60분 동안 흔들면서 섭씨 4도에서 샘플을 배양합니다.
마지막으로, 40 마이크로리터의 멤브레인 여과 PEB 염색 버퍼로 샘플을 희석시키고 유동 세포 측정 분석을 수행합니다. 이 프로토콜에서 EV는 UFC 및 UC-DGC 방법을 사용하여 마우스 BAL 유체로부터 분리되었습니다. BAL 유체 파생 EV는 UFC 방법에 의해 분리된 일반 마우스로부터 UC-DGC-EV보다 더 작은 크기와 균일한 크기 분포를 나타냈다.
UFC 기술은 또한 UC-DGC 기술에 비해 훨씬 더 높은 총 입자 수를 가지고 있었다. UFC-EV의 밀리그램으로 측정된 총 단백질 회수도 UC-DGC-EV의 단백질 회복보다 높았으며, 이는 UFC 기술이 더 많은 시간과 노력 효율적이라는 것을 나타냅니다. 마지막으로, BAL 유체 유래 EV는 또한 유동 세포측정을 통해 더욱 특징지어졌다.
UFC-EV와 UC-DGC-EV는 모두 CD63, CD9, CD81을 표현했다. 이 절차를 시도하는 동안 DPBS로 초여과 장치 멤브레인을 수화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 멤브레인이 수화되면 장치가 사용될 때까지 항상 젖어 있어야 합니다.
필터 장치에서 세포 외 소포 를 회수하는 것은 어려울 수 있습니다. 파이펫 팁이 필터 장치에서 EV의 대부분을 복구하기 위해 좌우로 스윕되어 있는지 확인합니다. 개발 후, 이 기술은 작은 동물의 정상 또는 병리학 적 조건에서 세포외 소포 유래 기관지 정맥포 라베이지의 생물학적 기능을 탐구하기 위해 세포 외 소포 격리 분야의 연구자들에게 길을 열었습니다.
