一种从人间充质干细胞中分离小细胞外囊泡的简单台式过滤方法

这是一种简单且时间有效的方案，用于从间充质干细胞中分离和浓缩小的细胞外囊泡。这种技术很容易在大多数实验室中采用，因为它是台式秤，只需要简单的仪器即可操作。为了分离小的细胞外囊泡，我们建议大规模生长细胞以获得至少一亿个细胞。

虽然听起来很简单，但通过视觉演示可以更好地了解该技术的某些关键步骤。我们希望研究人员能够从我们的经验中学习并自信地掌握这些技能。我们的博士生陈洪浩先生将指导您了解我们在间充质干细胞中分离和表征小细胞外囊泡的经验。

首先，将200g的条件培养基在4摄氏度下离心5分钟以除去细胞碎片。通过0.22微米过滤器收集和过滤上清液，以去除大于220纳米的颗粒。用30毫升0.2微米过滤磷酸盐缓冲盐水填充离心过滤单元。

然后将离心过滤单元在3， 500g的温度下在4摄氏度下离心5分钟。将溶液丢弃在滤液溶液杯中。将70毫升过滤条件培养基加入离心过滤单元中，并在4摄氏度下以3， 500g离心该单元。

将溶液丢弃在滤液溶液杯中。加入30毫升过滤的磷酸盐缓冲盐水，并在4摄氏度下以3， 500g离心该装置。在过滤装置上安装浓缩收集杯，并在4摄氏度下以1， 000g反向离心两分钟，以获得纯化的小细胞外囊泡。

通过0.22微米注射器过滤器过滤小的细胞外囊泡。将样品转移到新试管中，并将其储存在80摄氏度下进行进一步分析。要开始纳米颗粒跟踪分析，将过滤的磷酸盐缓冲盐水中分离的人脐带衍生间充质干细胞小细胞外囊泡稀释至每帧 20 至 100 个颗粒。

使用一毫升一次性注射器将一毫升稀释的样品引入抗A室。相应地设置测量设置。将摄像机级别调整为级别 14。

对于每个测量，单击标准测量并相应地设置稀释度。接下来，单击捕获，启动相机，并将相机级别设置为 14 以可视化小型 EV。要启动测量，请单击创建，然后单击运行脚本，然后选择需要保存文件的位置。

键入示例的必要详细信息，然后单击“确定”。单击设置“确定”继续执行脚本，然后单击“确定”启动测量。记录测量结果后，以 5 的检测阈值分析结果，包括每帧 10 到 100 个红叉。蓝十字计数限制为五个。

单击设置确定以继续脚本并启动分析。在脚本完成通知和导出上单击“确定”，将数据导出到设置的位置。用冰冷的放射免疫沉淀测定裂解缓冲液裂解人脐带来源的间充质干细胞小细胞外囊泡，并在 4 摄氏度下孵育 30 分钟。

在4摄氏度下以200g离心5分钟后收集上清液。使用BCA测定定量蛋白质。相应地组装凝胶电泳装置，并在90伏下进行凝胶电泳，直到蛋白质到达堆叠凝胶的末端。

将电压更改为200伏以分离蛋白质，直到分离凝胶结束。进行半干转印，将蛋白质从凝胶转移到15伏的聚偏二氟乙烯膜上一小时。在室温下摇床上用 3% 牛血清白蛋白在 0.1% 吐温 20 的三缓冲盐水中封闭 PVDF 膜一小时。

将PVDF膜与一抗在4摄氏度下孵育过夜，并不断摇动。第二天，用TBST洗涤PVDF膜五次，每次五分钟，并在室温下搅拌下与二抗进一步孵育一小时。同样，用TBST洗涤PVDF膜五次，并使用化学发光检测试剂在电荷耦合成像仪中可视化膜。

使用 ImageJ 软件分析蛋白质的表达水平。首先，在 ImageJ 中打开图像文件。通过调整亮度和对比度来提高图像质量。

调整图像，直到印迹清晰可见。单击“应用”按钮，然后将图像保存为TIFF格式。对于基于透射电子显微镜的分析，用四份过滤的磷酸盐缓冲盐水稀释一部分人脐带衍生的间充质干细胞小细胞外囊泡样品至总体积为10微升，并在碳涂层铜网格上孵育15分钟。

使用实验室擦拭布取出多余的样品，使其风干三分钟。孵育 10 微升 1% 磷钨酸溶液，使样品染色三分钟。使用实验室擦拭布去除多余的1%磷钨酸溶液，使其风干三分钟，以在透射电子显微镜下成像。

人脐带来源的间充质干细胞小细胞外囊泡的粒径模式为53纳米，而其他显著的粒径峰为96纳米和115纳米。NTA测量的人脐带来源MSC小细胞外囊泡的浓度为每毫升10至第10颗粒的7.75倍。用BCA测定法测量的人脐带来源MSC小细胞外囊泡的蛋白质浓度约为每毫升80微克。

在蛋白质印迹分析中，人脐带来源的MSC小细胞外囊泡显示外泌体标志物CD9、CD81和TSG101呈阳性条带，但GRP94呈阴性。分离的人脐带来源的MSC小细胞外囊泡在TEM下可视化以确定其大小和形态。人脐带来源的间充质干细胞小细胞外囊泡尺寸约为100纳米，并显示出杯状双层膜结构。

随着协议的成功开发，我们现在可以揭示再生医学中衍生的小细胞外囊泡的间充质干细胞的治疗潜力。