Este método pode ajudar a abordar questões relacionadas à eficiência, rendimento de recuperação e pureza do fluido de lavage broncoalveolar derivado de vesículos extracelulares usando uma abordagem de centrifugação de ultrafiltração. Comparamos diretamente esta técnica com uma técnica de purificação de gradiente de ultracentrifugação e densidade. A principal vantagem dessa técnica é que ela é simples, eficiente e adequada para amostras de pequenos volumes, como o fluido de lavage de broncoalveolar murine.
Mais importante, fornece alta pureza e escalabilidade significativamente maior em comparação com um método de isolamento de ultracentrifugação. Demonstrando o procedimento será o Sr. Norman Garrett III, pesquisador associado do meu laboratório. Para começar, insira um angiocateter de calibre 22 na traqueia de um rato eutanizado.
Conecte uma seringa de insulina com um mililitro de DPBS estéril gelado, e incutir um mililitro em ambos os pulmões. Retire lentamente o êmbolo da seringa para recuperar o fluido de lavagem broncoalveolar, ou fluido BAL. E distribua o fluido BAL em um tubo cônico no gelo.
Depois disso, puxe o fluido BAL de 25 ratos e divida-o em dois conjuntos iguais. Centrifugar o fluido BAL a 400 vezes G por cinco minutos a quatro graus celsius. Colete o supernaspe e centrifuá-lo a 15.000 vezes G a quatro graus celsius por 10 minutos.
Em seguida, colete o supernasce e prossiga para as etapas de isolamento do EV imediatamente. Primeiro, filtre o super natant através de um filtro de seringa estéril de 0,2 micrômetro. Depois disso, equilibre a unidade do filtro centrífuga com DPBS estérei por 10 minutos.
Em seguida, centrifugar a unidade centrífuga a 15.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus celsius. Encha o filtro com 15 mililitros de fluido BAL. E centrifuá-lo a 3.000 G's por 30 minutos a quatro graus celsius.
Depois disso, lave o retentato com 14 mililitros de DPBS estéreis, tubos suavemente repetidamente. Centrifugar a unidade do filtro a 3.000 G's a 4 graus celsius por 30 minutos para remover o DPBS e concentrar o retentato. Para coletar os EV derivados do fluido BAL concentrado, insira uma pipeta na parte inferior da unidade do filtro e retire a amostra usando um movimento de varredura lateral para o lado.
Em seguida, aliquot o fluido BAL derivado EV e armazená-los a menos 80 graus celsius. Alternativamente, comece transferindo o supernasal adquirido anteriormente para um tubo ultracentrífuga. E centrifuá-lo a 10.000 G's por 30 minutos a quatro graus celsius.
Em seguida, colete o supernatante e centrífuga. Descarte o supernatante e suspenda a pelota EV em 200 microlitrais da DPBS. Depois disso, misture a suspensão EV com 300 microliters de solução de trabalho de 50%iodixanol.
E transferi-lo para um tubo ultracentrífuga de 15 mililitros. Em seguida, adicione a solução tampão de acordo com o protocolo de texto para criar um gradiente de densidade flutuante e centrifuá-lo a 100.000 G's por três horas e 50 minutos. Colete as frações de 15% e 25% iodixanol, e dilua-as em DPBS para levar o volume até 15 mililitros.
Transfira as frações para um novo tubo de ultracentrifuugação e centrífuga a 100.000 G's a 4 graus celsius por 60 minutos. Descarte o supernatante e suspenda as pelotas EV em 50 microlitrais de DPBS estéreis. Para iniciar a análise de rastreamento de partículas nano, diluir a amostra de EV em um mililitro de DPBS.
E carregue a amostra em uma seringa de insulina. Depois disso, conecte a seringa a uma bomba de seringa e meça os números e o tamanho das partículas. Defina o nível da câmera para 14 e o limiar de detecção para um.
Em seguida, use um leitor de placas para quantificar a quantidade de proteína na amostra de EV através da detecção colorimétrica. Dissolva uma quantidade igual de proteína EV de cada amostra com um tampão de carga de manchas e DTT. Em seguida, aqueça as amostras a 70 graus celsius por 10 minutos.
Carregue as amostras em um gel de acrilamida Bis-Tris Plus e execute eletroforese por 35 minutos. Em seguida, transfira as proteínas para uma membrana de nitrocelulose usando um método de transferência seca. Depois disso, bloqueie a membrana com 5% de leite desnatado por 60 minutos com balanço suave.
Incubar a membrana com um anticorpo a um marcador de proteína superficial EV a quatro graus celsius com balanço suave durante a noite. Desenvolva a membrana incubando a membrana com anticorpo de ligação HRP por 60 minutos à temperatura ambiente. Lave a membrana por 10 minutos com tampão TBST três vezes.
Finalmente, desenvolva a membrana com reagente de detecção de anticorpos HRP quemiluminescente antes de proceder à imagem. Para iniciar a citometria de fluxo, diluir os EV derivados do fluido BAL em 49 microliters de tampão de coloração PEB. Em seguida, adicione três anticorpos a cada uma das amostras, antes de incubar as amostras a quatro graus celsius com balanço por 60 minutos no escuro.
Por fim, diluir as amostras com 40 microlitadores de tampão de coloração de FPE filtrado de membrana e realizar a análise da citometria de fluxo. Neste protocolo, os EV foram isolados do fluido BAL do mouse usando métodos UFC e UC-DGC. Os EV derivados do fluido BAL de camundongos normais isolados pelo método UFC apresentaram tamanhos menores e distribuição de tamanho mais uniforme do que os UC-DGC-EV.
A técnica do UFC também apresentou contagem total significativamente maior de partículas quando comparada com a técnica UC-DGC. A recuperação total da proteína medida em miligramas dos UFC-EV também foi maior do que a do UC-DGC-EV, indicando que a técnica do UFC é mais eficiente em tempo e esforço. Finalmente, os EV derivados do fluido BAL também foram caracterizados por citometria de fluxo.
Os UFC-EV e o UC-DGC-EV expressaram CD63, CD9 e CD81. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de reidratar a membrana da unidade de ultrafiltração com DPBS. Uma vez que a membrana esteja hidratada, a unidade precisa ser mantida molhada o tempo todo até ser usada.
Recuperar retentato vesícula extracelular da unidade do filtro pode ser um desafio. Certifique-se de que a ponta da pipeta seja varrida de um lado para o outro para recuperar a maior parte dos EV da unidade do filtro. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo do isolamento de vesículas extracelulares explorarem as funções biológicas de vesículos extracelulares derivados de lavage broncoalveolar em condições normais ou patológicas em animais de pequeno porte.
