この方法は、限外濾過遠心分離アプローチを用いて、気管支肺胞溶岩液由来の気管支肺胞溶岩液の効率、回収収率、純度に関する質問に対処するのに役立ちます。この技術を超遠心化と密度勾配精製技術と直接比較した。この技術の主な利点は、それが簡単で効率的で、マウス気管支肺胞洗浄液などの少量サンプルに適していることです。
さらに重要なのは、超遠心分離法に比べて高純度で拡張性が著しく高くなることです。この手順を実証することは、私の研究室の研究員であるノーマン・ギャレット3世です。まず、安楽死させたマウスの気管に22ゲージの血管カテーテルを挿入します。
1ミリリットルの氷冷滅菌DPBSでインスリン注射器を取り付け、両方の肺に1ミリリットルを植え付けます。気管支肺胞洗浄液、またはBAL液を取り出すためにゆっくりと注射器プランジャーを引き出します。そして、氷の上の円錐管にBAL流体を分配します。
この後、25匹のマウスからBAL液を引き出し、2つの等しいセットに分けます。400倍GでBAL液を摂氏4度で5分間遠心する。上清を集め、摂氏4度で15,000倍Gで10分間遠心分離します。
その後、上清を収集し、すぐにEV分離手順に進みます。まず、0.2マイクロメートルの滅菌シリンジフィルターを通してスーパーナタントをフィルターします。この後、遠心フィルターユニットを滅菌DPBSで10分間平衡化する。
その後、遠心単位を摂氏4度で10分間15,000倍Gで遠心分離します。15 ミリリットルの BAL 液でフィルターを充填します。そして、摂氏4度で30分間3,000 Gで遠心分離します。
この後、14ミリリットルの無菌DPBSでリテン酸を軽くピペット処理して繰り返し洗浄します。フィルター単位を摂氏4度で3,000Gで遠心し、DPBSを取り除き、再狭窄を濃縮する。濃縮BAL流体由来EVを収集するには、フィルターユニットの底部にピペッタを挿入し、側面から横へのスイープ動作を使用してサンプルを引き出します。
その後、BAL流体由来EVをアリクォートし、マイナス80°Cで保存します。あるいは、先に、先に取得した上清を超遠心チューブに移す。そして、摂氏4度で30分間10,000 Gで遠心分離します。
その後、上清と遠心分離機を収集します。上清を捨て、200マイクロリットルのDPBSでEVペレットを再懸濁します。この後、EV懸濁液を50%イオジキサノール作動溶液の300マイクロリットルと混合する。
そして15ミリリットルの超遠心チューブに移す。次に、テキストプロトコルに従ってバッファ溶液を追加して浮力密度勾配を作成し、遠心分離機を100,000 Gで3時間50分間追加します。15%と25%のイオデキサノール分画を収集し、15ミリリットルまでの体積をもたらすためにDPBSでそれらを希釈します。
100,000 Gの新しい超遠心チューブと遠心分離機に4°Cで60分間移動します。上清を捨て、50マイクロリットルの無菌DPBSでEVペレットを再中断します。ナノ粒子追跡解析を開始するには、EVサンプルを1ミリリットルのDPBSで希釈します。
そして、インスリン注射器にサンプルをロードします。この後、シリンジをシリンジポンプに取り付け、粒子数とサイズを測定します。カメラレベルを 14 に設定し、検出しきい値を 1 に設定します。
次に、プレートリーダーを使用して、色分け検出を介してEVサンプル中のタンパク質の量を定量化します。各サンプルから同量のEVタンパク質をブロッティングローディングバッファーと DTT で溶解します。その後、70°Cで10分間加熱します。
サンプルをビストリプラスアクリルアミドゲルにロードし、35分間電気泳動を実行します。次に、乾燥移動法を用いてニトロセルロース膜にタンパク質を移す。この後、穏やかな揺れで60分間5%の脱脂ミルクで膜をブロックします。
一晩穏やかな揺れで4°CでEV表面タンパク質マーカーに抗体で膜をインキュベートします。膜をHRPリンク抗体で室温で60分間インキュベートして開発します。膜をTBSTバッファーで10分間洗浄します。
最後に、イメージングに進む前に、化学発光HRP抗体検出試薬で膜を開発します。フローサイトメトリーを開始するために、49マイクロリットルのPEB染色バッファーでBAL流体由来EVを希釈した。次に、サンプルのそれぞれに3つの抗体を加え、暗闇の中で60分間揺れ動かしてサンプルを摂氏4度でインキュベートします。
最後に、40マイクロリットルの膜濾過されたPEB染色バッファーでサンプルを希釈し、フローサイトメトリー分析を行います。このプロトコルでは、EVは、UFCおよびUC-DGC法を用いてマウスBAL流体から分離した。BAL流体は、UFC法によって単離された正常マウス由来のEVを導出し、UC-DGC-EVよりも小さいサイズおよびより均一なサイズ分布を示した。
また、UFC技術は、UC-DGC技術と比較して、総粒子数が有意に高い。UFC-EVのミリグラムで測定された総タンパク質回収率もUC-DGC-EVのそれよりも高く、UFC技術がより時間と労力の効率的であることを示しています。最後に、BAL流体由来EVもフローサイトメトリーを介してさらに特徴付けられていた。
UFC-EVとUC-DGC-EVは、いずれもCD63、CD9、CD81を表現した。この手順を試みている間、DPBSで限外濾過ユニット膜を水分補給することを忘れないでください。膜が水和したら、単位は使用されるまで常に濡れておく必要があります。
フィルターユニットから細胞外小胞リテン酸を取り出すことは困難です。フィルターユニットからEVの大部分を回復するために、ピペットチップが左右にスイープされていることを確認してください。その開発後、この技術は、細胞外小胞の分離の分野の研究者が、小動物の正常または病理学的状態の両方で気管支肺胞溶岩由来の細胞外小胞の生物学的機能を探求する道を開いた。
