この方法は、肥満、非アルコール性脂肪肝、および2型糖尿病における肝エネルギーおよびタンパク質生合成の分子変化に関する様々な代謝疾患研究分野における重要な質問に答える助けとなる。この技術の主な利点は、非放射性標識基質を介して機能的な一次マウス肝細胞および検出肝新生タンパク質の単離を容易にすることである。この方法の視覚的なデモンストレーションは、灌流ステップが小さく、細いマウス血管のために学ぶのが難しいので重要です。
肝臓灌流の場合は、右腎静脈との分岐で、24ゲージカテーテルを下の静脈カバまたはIVCに慎重に挿入します。カテーテル針を取り外し、IVC内でカニューレの位置を維持し、コネクタを使用して24ゲージカニューレを灌流管に接続します。4ミリリットルの永久流量で肝臓を温かいHBSSマイナスで穿ファジングし始めると、脾臓静脈を切断して内部血液を排出します。
10分後、マウス肝臓に35ミリリットルのHBSSとコラゲラーゼタイプXを1分間に4ミリリットルの流量で補い、脾静脈を数分ごとに約10秒間クランプして肝臓全体の浸透液の分布を促進する。すべてのコラゲラーゼが浸透したら、肝臓に血液の逆流を避けるためにポンプを停止する前に、ラボ組織に肝臓を移します。鉗子を使用して胆嚢を取り除き、新鮮なラボ組織で肝臓を静かに拭いて血液を取り除きます。
5ミリリットルの新鮮な暖かいHBSSとコラゲターゼを補充した100ミリメートルのペトリ皿に肝臓を入れ、迷子の鉗子を使って肝臓カプセルを穏やかに取り除きます。鉗子を使用して慎重にパレンキマル組織を分散させ、ペトリ皿に15ミリリットルの冷たいDMEMを加えます。引き裂かれた肝臓を穏やかに振って残留の小形細胞を培地に放出し、さらに15ミリリットルの冷たいDMEMを皿に加えて残りの細胞を獲得する。
その後、100ミクロンの細胞ストレーナーを通して、氷の上の50ミリリットルの円錐管に組織スラリーをろ過します。一次マウス肝細胞を単離するには、遠心分離によって細胞を収集し、新鮮なDMEMの10ミリリットルでペレットを再懸濁します。密度勾配分離のために40%密度の勾配バッファーに細胞を慎重に重ね、遠心分離後に上層と中央層から細胞を廃棄します。
一次層状肝細胞ペレットをウィリアムのミディアムEの2~3ミリリットルで再懸濁して、チューブの壁から死んだ細胞を採取することを避け、細胞を新しい50ミリリットルチューブに移します。遠心分離前にウィリアムのE培地の追加7〜8ミリリットルと細胞を混合し、ペレットの大きさに応じて新鮮なウィリアムのミディアムEの10、20、または30ミリリットルでペレットを再中断します。カウント後、摂氏37度で2〜3時間のインキュベーションのために6ウェルプレートの各ウェルに60〜5番目の細胞にシード。
インキュベーションの終了時に、10%の胎児の牛血清を添加したDMEMと抗抗抗薬を培地に交換して、死んだ細胞と未結合の細胞を除去し、細胞を一晩インキュベーターに戻します。アジド修飾新規タンパク質標識の場合、2X反応バッファーの50マイクロリットルに20〜40マイクログラムの細胞ライセートを加えます。蒸留脱イオン水で80マイクロリットルの体積を持ち、タンパク質溶液を5秒間ボルテックスします。
別の5秒渦のために細胞に硫酸銅の5マイクロリットルを追加し、次に5秒の渦を持つ反応緩衝剤1の5マイクロリットルが続きます。3分間のインキュベーションの後、再構成された反応バッファー添加剤10マイクロリットルを細胞に2つ加えて別の5秒渦を加え、光から保護されたマルチ回転機で4°Cでサンプルを20分間回転させます。回転の終わりに、300マイクロリットルのメタノールをリセートに加え、続いて75マイクロリットルのクロロホルム、200マイクロリットルの二重蒸留水を加える。
遠心分離によって標識されたタンパク質を収集し、ペレットに新鮮なメタノールの250マイクロリットルを追加します。ボルテックス後、再びリセートを遠心分離し、室温で15分間、糸くずのない組織で裸ペレットを覆います。PAGE分析のために、乾燥したペレットをβ-メルカプトエタノールおよび渦液なしで20マイクロリットルの負荷バッファーで10分間可溶化する。
次に、タンパク質を摂氏70度のヒートブロックで10分間加熱し、テトラメチルロダミン検出用の10%ドデシル硫酸ナトリウムゲルにサンプルをロードします。次に、可変モードのレーザースキャナーを使用して、AHA標識された新生タンパク質を正確に定量します。組織学的には、生きて、そして付着した原発肝細胞は、典型的には、培養の24時間後に明確に輪郭を描いた膜境界を有する形状の多角形または六角形に現れる。
単離された細胞が原発性肝細胞であるかどうかを確認するために、本実験では、アルブミンタンパク質発現レベルをマウス胚性線維芽細胞、マウス肝腫細胞株、単離された一次マウス肝細胞、およびマウス肝で比較した。アルブミンタンパク質発現は、マウス肝細胞およびマウス肝の一次マウスで検出されたが、マウス胚性線維芽細胞または肝細胞株細胞のいずれにも検出できなかった。10ミクロモルロテノンを4〜6時間用いた一次肝細胞治療は、生体内で観察されたものと同様の肝AMP活性化プロテインキナーゼT172のリン酸化レベルの増加によって検出された肝AMP活性化プロテインキナーゼの堅牢な誘導を明らかにした。
実際、5時間の10マイクロモルロテノン治療は、化学選択的ライゲーション反応アッセイによって示されるように、未処理の肝細胞と比較して、処理された原発肝細胞における新生タンパク質合成に対して深い阻害効果を有した。この手順を試みる間、すべての必要な試薬および媒体を事前に準備することを忘れないでください。この技術は、肝代謝病態生理学の分野の研究者が、単離された原発マウス肝細胞における肥満および2型糖尿病におけるエネルギータンパク質調節の分子メカニズムを探求する道を開いた。
