Bu yöntem, obezitede karaciğer enerjisi ve protein biyosentezinin moleküler değişimleri, alkolsüz yağlı karaciğer ve tip iki diyabet ile ilgili çeşitli metabolik hastalık araştırma alanlarındaki anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin başlıca avantajları, fonksiyonel primer fare hepatositlerinin izolasyonu ve radyoaktif olmayan bir etiketleme substratı ile hepatik yeni doğan proteinlerin saptanmasını kolaylaştırmasıdır. Perfüzyon adımı küçük ve ince fare kan damarları nedeniyle öğrenmesi zor olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi önemlidir.
Karaciğer perfüzyonu için, inferior Vena Cava veya IVC içine sadece sağ renal ven ile çatallanma içine 24 gauge kateter yerleştirin. IVC içindeki kanülün konumunu koruyan kateter iğnesini çıkarın ve konektörü kullanarak perfüzyon tüpüile 24 kalibrelik bir kanül bağlayın. Dört mililitre kalıcı akış hızında sıcak HBSS eksi ile karaciğer perfüzyon başlayın hızlı bir şekilde iç kan drenaj için dalak damar kesme.
10 dakika sonra, HBSS 35 mililitre artı dakikada dört mililitre bir akış hızında Kollajenaz Tip X ile desteklenen fare karaciğer perpin, karaciğer boyunca perfusate dağılımını kolaylaştırmak için yaklaşık 10 saniye her birkaç dakikada bir dalak ven kenetleme. Tüm Kollajenaz perfüzyon olduğunda, karaciğer içine kan geri akışını önlemek için pompa durdurmadan önce bir laboratuvar dokusu üzerine karaciğer transferi. Safra kesesi kaldırmak ve yavaşça herhangi bir kan kaldırmak için taze bir laboratuvar dokusu ile karaciğer silmek için forceps kullanın.
Taze sıcak HBSS artı Kollajenaz ile desteklenen beş mililitre içeren bir 100 milimetre Petri çanak karaciğer yerleştirin ve yavaşça karaciğer kapsülü kaldırmak için başıboş uçlu forceps kullanın. Parenkimal dokuyu dikkatlice dağıtmak ve Petri kabına 15 mililitre soğuk DMEM eklemek için forceps kullanın. Orta içine artık parankimal hücreleri serbest bırakmak için yavaşça yırtık karaciğer çalkalayın ve hücrelerin geri kalanını elde etmek için çanak soğuk DMEM başka bir 15 mililitre ekleyin.
Sonra doku bulamacını 100 mikron hücreli süzgeçten 50 mililitrelik konik bir tüpe süzün. Birincil fare hepatositleri izole etmek için, hücreleri santrifüj ile toplayın ve 10 mililitre taze DMEM'de peleti yeniden askıya alın. Yoğunluk gradyan ayırma için %40 yoğunluk gradyan arabelleği üzerinde hücreleri dikkatlice katmanlayarak, santrifüjden sonra hücreleri üst ve orta katmanlardan atın.
Tüpün duvarından ölü hücrelerin toplanıp hücreleri yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarmak için William'ın Orta E'sinin 2-3 mililitrelik birincil parenkimal hepatosit peletini yeniden askıya alın. Santrifüjden önce 7-8 mililitre William's E Medium ile hücreleri karıştırın ve peletin büyüklüğüne bağlı olarak 10, 20 veya 30 mililitre taze William's Medium E'de peleti yeniden askıya alın. Saydıktan sonra, tohum altı kez 10 beşinci hücrelere altı iyi bir tabak için 37 santigrat derece bir 2-3 saatlik kuluçka için.
Kuluçka sonunda, ölü ve bekar hücreleri kaldırmak ve bir gecede kuvöze hücreleri dönmek için% 10 Fetal Sığır Serum ve anti-anti ile takviye DMEM ile orta değiştirin. Azide modifiye edilmiş yeni doğan protein etiketlemesi için, 2X reaksiyon tamponunun 50 mikrolitresine 20 ila 40 mikrogram hücre lisat ekleyin. Distile deiyonize su ile 80 mikrolitre hacmi getirin ve beş saniye boyunca protein çözeltisi girdap.
Başka bir beş saniyelik girdap için hücrelere bakır sülfat beş mikrolitre ekleyin, reaksiyon tampon bir beş saniye girdap ile beş mikrolitre takip. Üç dakikalık bir kuluçkadan sonra, 10 mikrolitre yeniden oluşturulmuş reaksiyon tamponu ilavesi iki sini hücrelere beş saniyelik bir girdap için ekleyin ve Numuneyi ışıktan korunan çok rotator bir makinede dört derecede 20 dakika döndürün. Rotasyon sonunda, lysate metanol 300 mikrolitre ekleyin, kloroform 75 mikrolitre takip, ve çift distile su 200 mikrolitre.
Santrifüj ile etiketli protein toplamak ve pelet taze metanol 250 mikrolitre ekleyin. Girdap sonra, tekrar lysate santrifüj ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir tiftik içermeyen doku ile çıplak pelet kapağı. PAGE analizi için, beta-mercaptoetanol olmadan yükleme tampon 20 mikrolitre kurutulmuş pelet solubilize ve girdap pelet için 10 dakika.
Daha sonra, proteini 70 derecelik bir ısı bloğunda 10 dakika ısıtın ve tetrametilodamin tespiti için numuneyi %10 sodyum dodecyl sülfat jeline yükleyin. Daha sonra AHA etiketli yeni doğan proteinlerin hassas niceliği için değişken modlu lazer tarayıcı kullanın. Histolojik olarak, canlı ve bağlı primer hepatositler, 24 saatlik kültürden sonra, tipik olarak çokgen veya altıgen bir şekilde, açıkça özetlenen bir membranöz sınırla görünürler.
İzole hücrelerin primer hepatosit olup olmadığını doğrulamak için bu deneyde albumin protein ekspresyonu düzeyleri fare embriyonik fibroblastları, fare hepatoma hücre hattı, izole primer fare hepatositleri ve fare karaciğerlerinde karşılaştırıldı. Primer fare hepatositleri ve fare karaciğerlerinde albumin protein ekspresyonu saptandı, ancak fare embriyonik fibroblastlarında veya hepatoma hücre hattında tespit edilemedi. 10 mikromolar Rotenon ile 4-6 saat boyunca primer hepatosit tedavisi, hepatik AMP-aktive protein kizide artmış fosforilasyon düzeyleri nin invivo gözlenenlere benzer şekilde saptandığı gibi hepatik AMP-aktive protein kizinin sağlam bir indüksiyonunu saptamıştır.
Nitekim, 10 mikromolar Rotenon tedavisibeş saat bir kemoseliye ligasyon reaksiyonu sonucu gösterildiği gibi tedavi edilmemiş kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında tedavi edilen primer hepatositlerde yeni doğan protein sentezi üzerinde derin inhibitör etkileri vardı. Bu yordamı çalışırken, gerekli tüm reaktifleri ve ortamları önceden hazırladığını unutmamak gerekir. Bu teknik, hepatik metabolik patofizyoloji alanında araştırmacının obezitede enerji proteinregülasyonunun moleküler mekanizmasını ve izole primer fare hepatositte tip iki diyabeti keşfetmesinin yolunu açmıştır.
