이 방법은 비만, 무알코올 지방 간 및 타입-2 당뇨병에 있는 간 에너지 및 단백질 생합성의 분자 변경에 관하여 각종 신진 대사 질병 연구 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기능성 1 차 마우스 간세포및 검출 간 초기 단백질의 분리를 비방사성 라벨기판을 통해 용이하게 한다는 것입니다. 이 방법의 시각적 데모는 크고 얇은 마우스 혈관 때문에 관류 단계가 배우기 어렵기 때문에 중요합니다.
간 관류의 경우, 오른쪽 신장 정맥으로 분기시 열등한 베나 카바 또는 IVC에 24 게이지 카테터를 조심스럽게 삽입하십시오. IVC 내의 캐뉼라 위치를 유지하는 카테터 바늘을 제거하고 커넥터를 사용하여 24 게이지 캐뉼라를 관류 튜브와 연결합니다. 4 밀리 리터 영구 유량에서 마이너스 따뜻한 HBSS와 간 을 perfusing 시작 신속 하 게 내부 혈액을 배출 하는 비장 정맥을 절단.
10분 후, 마우스 간을 HBSS 35밀리리터와 콜라게나제 타입 X로 분당 4밀리리터의 유속으로 보충하여 몇 분마다 약 10초 간간 에서 배반물의 분포를 용이하게 합니다. 콜라게나아제의 모든 perfused 되었습니다 때, 간 간으로 혈액 역류를 피하기 위해 펌프를 중지 하기 전에 실험실 조직에 간 전송. 집게를 사용하여 담낭을 제거하고 신선한 실험실 조직으로 간을 부드럽게 닦아 혈액을 제거하십시오.
간을 신선한 따뜻한 HBSS 5밀리리터와 콜라게나아제로 보충한 100mm 페트리 접시에 간을 넣고 길 잃은 포셉을 사용하여 간 캡슐을 부드럽게 제거합니다. 집게를 사용하여 빈약한 조직을 조심스럽게 분산시키고 페트리 접시에 15 밀리리터 콜드 DMEM을 추가하십시오. 찢어진 간을 부드럽게 흔들어 잔류 완두엽 세포를 배지에 방출하고 나머지 세포를 획득하기 위해 접시에 차가운 DMEM의 또 다른 15 밀리리터를 추가하십시오.
그런 다음 100 미크론 세포 여과기를 통해 얼음에 50 밀리리터 원문 튜브로 조직 슬러리를 필터링합니다. 1차 마우스 간세포를 분리하려면 원심분리로 세포를 수집하고 신선한 DMEM의 10 밀리리터에서 펠릿을 재보종한다. 밀도 그라데이션 분리를 위해 40% 밀도 그라데이션 버퍼 위에 세포를 조심스럽게 레이어링하여 원심 분리 후 상부 및 중간 층에서 셀을 폐기합니다.
관의 벽에서 죽은 세포를 수집하는 것을 피하고 새로운 50 밀리리터 튜브로 세포를 전송하기 위해 윌리엄의 중간 E의 2 ~ 3 밀리리터와 기본 parenchymal cyte 펠릿을 다시 중단합니다. 원심분리 전에 윌리엄의 E 매체의 7~8밀리리터와 세포를 섞고 펠릿크기에 따라 10, 20 또는 30밀리리터의 신선한 윌리엄 미디엄 E에서 펠릿을 재보페치한다. 계산 후, 씨앗 은 섭씨 37도에서 2 ~ 3 시간 배양에 대한 6 웰 플레이트의 각 우물에 다섯 번째 세포에 10 번.
인큐베이션의 끝에서, 배지를 10%의 태아 소 혈청과 항반대로 보충한 DMEM으로 대체하여 죽은 세포와 부착되지 않은 세포를 제거하고 세포를 하룻밤 동안 인큐베이터로 되돌려 보도록 한다. 아지드 변형 초기 단백질 라벨링을 위해 20~40마이크로그램의 세포 용액을 2X 반응 버퍼 50마이크로리터에 추가하십시오. 증류된 탈이온수로 80마이크로리터에 볼륨을 가져와 단백질 용액을 5초 동안 소용돌이시세요.
또 다른 5 초 소용돌이에 대한 세포에 구리 황산염의 5 마이크로 리터를 추가, 소용돌이의 5 초 와 반응 완충 제 첨가제 의 다섯 마이크로 리터 다음. 3분 간 인큐베이션 을 한 후, 5초 의 소용돌이에 대해 셀에 재구성된 반응 완충 첨가제 2개 10마이크로리터를 추가하고 빛으로부터 보호되는 다중 회전기 기계에서 섭씨 4도에서 20분 동안 샘플을 회전시킵니다. 회전이 끝나면 300 마이크로리터의 메탄올을 리사테에 넣고, 그 다음으로 75마이크로리터의 클로로폼과 200마이크로리터의 이중 증류수를 첨가한다.
표기 된 단백질을 원심분리에 의해 수집하고 펠릿에 신선한 메탄올 250 마이크로 리터를 추가하십시오. 소용돌이 후, 원심분리는 다시 lysate을 하고 실온에서 15 분 동안 보풀이없는 조직으로 맨살 펠릿을 덮습니다. PAGE 분석을 위해, 베타-메르카토에탄올 없이 20 마이크로리터의 적재 버퍼에서 말린 펠릿을 용해시키고 펠릿을 10분 동안 소용돌이시킵니다.
다음으로, 단백질을 섭씨 70도의 열 블록에서 10분 동안 가열하고 테트라메틸뢰다민 검출을 위해 10% 나트륨 도데실 황산염 젤에 샘플을 적재한다. 그런 다음 AHA 표지된 초기 단백질의 정확한 양을 위해 가변 모드 레이저 스캐너를 사용합니다. 조직학적으로, 살아있는 및 부착된 1차 간세포는 24시간의 문화 후에 명확하게 설명된 음근 경계와 모양으로 일반적으로 다각형 또는 육각형을 나타납니다.
고립 된 세포가 1 차적인 간세포인지 확인하기 위해, 이 실험에서 알부민 단백질 발현 수준은 마우스 배아 섬유아세포, 마우스 간종 세포주, 분리된 1차 마우스 간세포 및 마우스 간에서 비교되었다. 알부민 단백질 발현은 1차 마우스 간세포 및 마우스 간에서 검출되었지만 마우스 배아 섬유아세포 또는 간종 세포 세포에서 검출할 수 없었다. 10 마이크로몰러 로테논을 4~6시간 동안 1차 간세포 치료는 생체내에서 관찰된 것과 유사한 간 AMP 활성화 단백질 키나아제 T172에 대한 인산화 수치가 증가함에 따라 간 AMP 활성화 단백질 키나아제의 강력한 유도를 밝혀냈습니다.
실제로, 5시간 동안 10개의 미세몰러 로테논 치료제는 화학선택적 결찰 반응에 의해 입증된 바와 같이 치료되지 않은 대조군 세포에 비해 처리된 1차 간세포에서 초기 단백질 합성에 대한 심오한 억제 효과가 있었다. 이 절차를 시도하는 동안 필요한 모든 시약과 매체를 미리 준비하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술은 간 대사 병리학 의 분야에서 연구원을위한 길을 포장하여 고립 된 1 차 마우스 간세포에서 비만 및 유형 2 당뇨병의 에너지 단백질 조절분자 메커니즘을 탐구했습니다.
