Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans divers domaines de recherche sur les maladies métaboliques sur les altérations moléculaires de l’énergie hépatique et la biosynthèse protéique dans l’obésité, le foie gras non alcoolique et le diabète de type deux. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle facilite l’isolement des hépatocytes fonctionnels primaires de souris et la détection des protéines hépatiques naissantes par l’intermédiaire d’un substrat d’étiquetage non radioactif. La démonstration visuelle de cette méthode est critique car l’étape de perfusion est difficile à apprendre en raison des vaisseaux sanguins de souris petits et minces.
Pour la perfusion du foie, insérez soigneusement un cathéter de calibre 24 dans le Véna Cava inférieur ou IVC juste à la bifurcation avec la veine rénale droite. Retirez l’aiguille du cathéter en maintenant la position de la canule dans l’IVC et connectez une canule de calibre 24 avec le tube de perfusion à l’aide du connecteur. Commencez à perfuser le foie avec hbss chaud moins à un débit permanent de quatre millilitres rapidement couper la veine splénique pour drainer le sang interne.
Après 10 minutes, infuser le foie de souris avec 35 millilitres de HBSS plus complété par collagène de type X à un débit de quatre millilitres par minute, serrant la veine splénique pendant environ 10 secondes toutes les quelques minutes pour faciliter la distribution du perfusate dans tout le foie. Lorsque toute la collagène a été perfusée, transférer le foie sur un tissu de laboratoire avant d’arrêter la pompe pour éviter le flux sanguin dans le foie. Utilisez des forceps pour enlever la vésicule biliaire et essuyez doucement le foie avec un tissu de laboratoire frais pour enlever tout sang.
Placer le foie dans une boîte de Pétri de 100 millimètres contenant cinq millilitres de HBSS chaud frais plus complété par de la collagène et utiliser des forceps à pointes parasites pour enlever délicatement la capsule hépatique. Utilisez les forceps pour disperser soigneusement le tissu parenchymal et ajouter 15 millilitres de DMEM froid à la boîte de Pétri. Secouez doucement le foie déchiré pour libérer les cellules parenchymales résiduelles dans le milieu et ajoutez encore 15 millilitres de DMEM froid au plat pour acquérir le reste des cellules.
Filtrez ensuite la boue tissulaire à travers une passoire cellulaire de 100 microns dans un tube conique de 50 millilitres sur la glace. Pour isoler les hépatocytes primaires de souris, recueillez les cellules par centrifugation et réutilisez la pastille en 10 millilitres de DMEM frais. Superposez soigneusement les cellules sur un tampon de gradient de densité de 40 % pour la séparation du gradient de densité, en jetant les cellules des couches supérieure et moyenne après centrifugation.
Resuspendez la pastille primaire d’hépatocyte parenchymal avec deux à trois millilitres du E moyen de William pour éviter de recueillir des cellules mortes de la paroi du tube et transférer les cellules dans un nouveau tube de 50 millilitres. Mélangez les cellules avec sept à huit millilitres supplémentaires de William’s E Medium avant la centrifugation et résuspendez la pastille en 10, 20 ou 30 millilitres de E moyen de William frais selon la taille de la pastille. Après compter, graine six fois 10 à la cinquième cellule à chaque puits d’une plaque de six puits pour une incubation de deux à trois heures à 37 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, remplacer le milieu par du DMEM complété par 10% de sérum bovin fœtal et anti-anti pour enlever les cellules mortes et non attachées et retourner les cellules à l’incubateur pendant la nuit. Pour l’étiquetage des protéines naissantes modifiées par l’azide, ajouter de 20 à 40 microgrammes de lysate cellulaire à 50 microlitres de tampon de réaction 2X. Porter le volume à 80 microlitres avec de l’eau déionisée distillée et vortexer la solution protéique pendant cinq secondes.
Ajouter cinq microlitres de sulfate de cuivre aux cellules pour un autre vortex de cinq secondes, suivi de cinq microlitres d’additif tampon de réaction avec cinq secondes de vortex. Après une incubation de trois minutes, ajouter 10 microlitres d’additif tampon de réaction reconstitué deux aux cellules pour un autre vortex de cinq secondes et faire pivoter l’échantillon pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius sur une machine multi-rotateur protégée de la lumière. À la fin de la rotation, ajouter 300 microlitres de méthanol au lysate, suivi de 75 microlitres de chloroforme et de 200 microlitres d’eau distillée double.
Recueillir la protéine étiquetée par centrifugation et ajouter 250 microlitres de méthanol frais à la pastille. Après vortex, centrifugeuse le lysate à nouveau et couvrir la pastille nue avec un tissu sans peluche pendant 15 minutes à température ambiante. Pour l’analyse page, solubiliser la pastille séchée dans 20 microlitres de tampon de chargement sans bêta-mercaptoéthanol et vortex la pastille pendant 10 minutes.
Ensuite, chauffer la protéine dans un bloc thermique de 70 degrés Celsius pendant 10 minutes et charger l’échantillon sur un gel de sulfate de dodecyl de 10 % pour la détection de la tétraméthylrhodamine. Utilisez ensuite un scanner laser à mode variable pour quantifier avec précision les protéines naissantes étiquetées AHA. Histologiquement, les hépatocytes primaires vivants et attachés apparaissent typiquement polygonaux ou hexagonaux dans la forme avec une frontière membranous clairement décrite après 24 heures de culture.
Pour confirmer si les cellules isolées sont des hépatocytes primaires, dans cette expérience, des niveaux d’expression de protéine d’albumine ont été comparés dans les fibroblastes embryonnaires de souris, une ligne cellulaire d’hépatome de souris, les hépatocytes primaires isolés de souris, et les foies de souris. L’expression de protéine d’albumine a été détectée dans les hépatocytes primaires de souris et les foies de souris, mais n’était pas détectable dans les fibroblastes embryonnaires de souris ou les cellules de ligne cellulaire d’hépatome. Le traitement primaire d’hépatocyte avec la rotenone de 10 micromolaire pendant quatre à six heures a indiqué une induction robuste de kinase hépatique de protéine AMP-activée telle que détectée par des niveaux accrus de phosphorylation sur le kinase t172 hépatique d’AMP-activé de protéine semblable à ceux observés in vivo.
En effet, cinq heures de traitement de Rotenone de 10 micromolar ont eu des effets inhibiteurs profonds sur la synthèse naissante de protéine dans les hépatocytes primaires traités comparés aux cellules de commande non traitées comme démontré par un essai de réaction de ligature chemosélective. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de préparer tous les reagents et les supports requis à l’avance. Cette technique a ouvert la voie au chercheur dans le domaine de la pathophysiologie métabolique hépatique pour explorer le mécanisme moléculaire de la régulation des protéines énergétiques dans l’obésité et le diabète de type deux dans l’hépatocyte primaire isolé de souris.
