在扩增时，心脏祖细胞（或CPC）的分化需要从增殖阶段到承诺阶段的相位转换，并且该协议在CPC中使用有效的内皮血统。该技术的一个主要优点是，它适用于基于多种技术和不同物种的分离的CPC。该协议可用于增强CPC在细胞治疗中的治疗潜力。
它还可用于研究分化的潜力和机制，以及这些差异如何受到心脏病的影响。CPC 是细胞的不均匀总体，其形状、大小和效力可能不同。因此，协议必须根据使用的CPC的特定子组进行调整。
麻醉鼠标后，用70%乙醇擦拭胸部。用剪刀切开皮肤和胸壁，露出胸腔。用钳子抬起心脏，然后用剪刀在底座上剪。
将心脏转移到含有五毫升冷 PBS 的 P60 培养皿中，然后用钳子泵送心脏，将血液从腔中喷出。将心脏放在含有五毫升冷 PBS 的 P60 盘中并清洗。用小剪刀取出心，把心脏切成两个纵向碎片，用五毫升的冰冷PBS洗净。
用小剪刀把心脏碎片切成小块。加入一滴 Hank 的平衡盐溶液，含有胶原酶 B，浓度为每毫升 1 毫克，并使用无菌剃刀刀片彻底切碎小心脏碎片。接下来，在菜中加入2.5毫升的胶原酶B溶液。
将菜以30度角放在37摄氏度的培养箱中。让碎块孵育最多30分钟，同时在孵育过程中每10分钟反复通过巴斯德移液器。首先，在切碎和均质的心脏部分添加五毫升的冷HSS，并辅以2%的FBS。
使用 100 微米过滤器，过滤心脏碎片以去除任何未消化的组织。在 470 倍 G 下离心，在室温下离心 5 分钟。丢弃上流剂，将颗粒重新悬浮在五毫升红细胞解液缓冲液中。
在冰上孵育五分钟，偶尔摇晃。在此之后，加入10毫升PBS，并通过40微米过滤器过滤样品，以排除更大的细胞，包括残余心肌细胞。在 470 倍 G 下离心，在室温下离心 5 分钟，不休息。
然后，重新悬浮DMEM中的细胞，辅以10%FBS，目标是最终细胞浓度为每毫升100万个细胞。将细胞分成两个管子进行染色和分拣，将1.5毫升的细胞溶液加入一个管中，将3.5毫升的细胞溶液添加到第二管中。加入 Hoechst 溶液，在 37 摄氏度下孵育 90 分钟，偶尔翻转，以确保染料的均匀分布，防止细胞凝血。
侧人口出现在霍赫斯特左下角的主要人口之外。在 FACS 图中，可以根据阴值控制来识别，其中 verapamil 会提示侧总体消失。预热介质1至37摄氏度，将离心机冷却至4摄氏度。
将分拣管在470倍G和4摄氏度下离心6分钟。然后，重新挂起介质中的单元格。将细胞转移到含有四毫升中培养的气体渗透P60盘中。
每三天更换一次培养，直到细胞达到70至80%培养SP-CPC之间的汇合，在T75烧瓶中用8毫升的培养剂在每瓶瓶中产生2至3天。接下来，小心吸气介质，用五毫升的暖HSS轻轻冲洗烧瓶。用5毫升的尝试性EDTA治疗细胞，在37摄氏度下用5%的二氧化碳治疗5分钟。
然后，加入五毫升的介质一，以停止三辛活性，并将细胞悬浮液转移到15毫升管。在室温下以 470 倍 G 离心五分钟。接下来，在一中或中二中重新挂起单元格。
将P60盘上的细胞镀上，每盘电镀25万个SP-CPC，用三毫升的介质含有不同的血清浓度。经过两天的培养，从每道菜中收集培养的培养器放入15毫升的管子中，收集死细胞。如先前所述，将粘附细胞进行尝试，将细胞悬浮液收集到包含收集的培养的15毫升管中。
在室温下以840倍G离心5分钟，然后吸升清液，并加入一毫升的介质一或中2用于细胞计数。用锥盘蓝色染色SP-CPC，并计算可行细胞和死细胞。首先，从准备好的细胞中吸出介质，然后用五毫升温暖的HSS轻轻冲洗。
在细胞培养箱中用五毫升的尝试性EDTA治疗细胞五分钟。然后，添加五毫升的介质一，以停止尝试性活动。将电池悬浮液转移到15毫升管中，在室温下以470倍G离心，5分钟。
吸上清液，并添加介质二进行细胞计数。接下来，将8万个细胞种子放入预涂的六井培养板的每一个井中，用三毫升的中二。将板在37摄氏度下保持20至24小时，然后将每井的介质更改为三毫升的中三。
培养板21天，每三天更换一次介质。在此之后，用内皮标记染色细胞，并进行荧光显微镜，以验证分化细胞的内皮性质。首先，从准备好的细胞中吸出介质，然后用五毫升温暖的HSS轻轻冲洗。
在细胞培养箱中用两毫升的尝试性EDTA治疗细胞五分钟，然后加入三毫升的中三，以停止尝试性活性。将电池悬浮液转移到15毫升管中，在室温下以470倍G离心，5分钟。吸上流液，并加入一毫升的中三，轻轻移液混合。
在100微升的中三层中，将细胞和种子数到2000到4000个细胞之间，每个基质都涂有96井板的井。在37摄氏度下孵育板16小时。在此之后，使用亮场显微镜在两倍的放大率拍摄细胞的照片。
本研究探讨了促进心脏祖细胞内皮血统承诺的适宜条件。当细胞汇合在或低于60%时，使用3.5%FBS处理的样品中无显著差异。当这种汇合的细胞被0.1%FBS治疗时，它们显示与纤维素相比，层压素上的细胞增殖减少，但细胞死亡没有增加。
相比之下，高汇合的细胞在两种条件下的细胞增殖或细胞死亡方面没有显著差异。细胞形状的变化似乎是一个指标，表明在适当的培养条件下，内皮分化将取得成功。在内皮分化培养基的7至14天内，成功的培养物被认为含有具有不同形态的较大细胞。
有趣的是，这些细胞在分化阶段结束时消失，并且往往以较低的数量出现，并在高密度培养物的后期出现。管的形成在低密度镀层和层压素上分化的细胞中始终是成功的，而在高密度镀层细胞中，管的形成大多失败。虽然管的形成在纤维素培养的细胞中大多不成功，而不管细胞密度如何，低密度分化的细胞有时形成初级管。
血清浓度和细胞密度诱导内皮血统至关重要，必须调整它们，以确保增殖的减缓，同时保持生存能力。在血统诱导时，来自人类的CPC或临床前疾病模型可用于细胞移植研究，以评估其体内分化潜力。该协议可以帮助研究或建立新的心脏再生工具，它以前曾用于研究早期血统承诺的分子机制。
