ההידול של תאי הצאצאים הלבביים, או CPCs, בעת הגברה דורש מעבר פאזה מהתרבות לשלב מחויב, ופרוטוקול זה משתמש בשושלת אנדותל יעילה ב- CPCs. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא שהיא חלה על CPCs מבודדים על סמך מספר טכניקות ומינים שונים. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לשפר את הפוטנציאל הטיפולי של CPCs לטיפול בתאים.
זה יכול לשמש גם כדי לחקור את הפוטנציאלים ואת המנגנונים של ההתברות וכיצד אלה מושפעים ממחלות לב. CPCs הם אוכלוסייה לא אנושית של תאים שעשויים להיות שונים בצורה, בגודל ובעוצמה. לכן, יש להתאים את הפרוטוקול בהתאם לתת-תפוקה הספציפית של CPCs המשמשים.
לאחר הרדמה של העכבר, לנגב את החזה שלה עם 70% אתנול. באמצעות מספריים, לחתוך את העור ואת קיר בית החזה כדי לחשוף את חלל בית החזה. השתמש מדפים כדי להרים את הלב, ולאחר מכן להשתמש במספריים לחתוך אותו בבסיס.
מעבירים את הלב לצלחת תרבות P60 המכילה חמישה מיליליטר של PBS קר, ולאחר מכן להשתמש במטלפים כדי לשאוב את הלב ולפלט את הדם מתוך החללים. מניחים את הלב בצלחת P60 המכילה חמישה מיליליטר של PBS קר ולשטוף אותו. השתמש מספריים קטנים כדי להסיר את האטריה, לחתוך את הלב לשתי חתיכות אורך, ולשטוף אותם חמישה מיליליטר של קרח קר PBS.
באמצעות מספריים קטנים, לחתוך את חתיכות הלב לחלקים קטנים יותר. הוסיפו טיפת תוסף מלח מאוזן של האנק המכיל קולגן B בריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר, ולהשתמש בסכין גילוח סטרילי כדי לטחון את חתיכות הלב הקטנות ביסודיות. לאחר מכן, מוסיפים 2.5 מיליליטר של תוסף הקולגנס B לצלחת.
מניחים את המנה בזווית של 30 מעלות באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס. תן חתיכות לב טחון דגירה לכל היותר 30 דקות תוך העברת אותם שוב ושוב דרך פיפטה פסטר כל 10 דקות במהלך הדגירה. ראשית, הוסיפו חמישה מיליליטר של HBSS קר בתוספת 2%FBS לחתיכות הלב הטחון וההומוגני.
באמצעות מסנן 100 מיקרומטר, לסנן את חתיכות הלב כדי להסיר כל רקמה מעוכל. צנטריפוגה ב 470 פעמים G ו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את גלולת הכדור בחמישה מיליליטר של חיץ תותלי דם אדומים.
דגירה על קרח במשך חמש דקות עם רעידות מדי פעם. לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של PBS ולסנן את המדגם באמצעות מסנן 40 מיקרומטר כדי לא לכלול תאים גדולים יותר כולל שאריות cardiomyocytes. צנטריפוגה ב 470 פעמים G ו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות ללא הפסקה.
לאחר מכן, להשעות מחדש את התאים ב- DMEM בתוספת 10%FBS, מכוון ריכוז התא הסופי של מיליון תאים למיליליטר. פזרו את התאים לשני צינורות להכתמה ומיון, והוסיפו 1.5 מיליליטר של תפתור התא לצינור אחד ו-3.5 מיליליטר לצינור השני. מוסיפים את פתרון Hoechst ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות עם היפוך מדי פעם כדי להבטיח הפצה שווה של הצבע ולמנוע קרישה של התאים.
האוכלוסייה הצדדית מופיעה בפינה השמאלית התחתונה הנמוכה של הויצ'אסט מלבד האוכלוסייה הראשית. בעלילה FACS ניתן לזהות אותו בהתבסס על הפקד השלילי שבו verapamil מבקש האוכלוסייה הצדדית להיעלם. מחממים בינוני אחד עד 37 מעלות צלזיוס ומצננים את הצנטריפוגה לארבע מעלות צלזיוס.
צנטריפוגה צינורות המיון ב 470 פעמים G וב ארבע מעלות צלזיוס במשך שש דקות. לאחר מכן, השהה מחדש את התאים בתא בינוני אחד. מעבירים את התאים לצלחת P60 חדירה לגז המכילה ארבעה מיליליטר של בינוני אחד.
שנה את המדיום כל שלושה ימים עד שהתאים הגיעו להתכנסות בין 70% ל- 80%Culture SP-CPCs למשך יומיים עד שלושה בבקבוקי T75 באמצעות שמונה מיליליטר של בינוני אחד בכל בקבוקון. לאחר מכן, שאפו בזהירות את המדיום ושטוף בעדינות את הבקבוק בחמישה מיליליטר של HBSS חם. לטפל בתאים עם חמישה מיליליטר של טריפסין EDTA במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
לאחר מכן, להוסיף חמישה מיליליטר של בינוני אחד כדי לעצור את פעילות טריפסין, ולהעביר את ההשעיה התא לצינור 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב 470 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השהה מחדש את התאים בתא בינוני אחד או בשניים בינוניים.
צלחת התאים על מנות P60, ציפוי 250, 000 SP-CPCs למנה עם שלושה מיליליטר של בינוני המכיל ריכוזי סרום שונים. לאחר יומיים של culturing, לאסוף את המדיום מכל מנה לתוך צינור 15 מיליליטר כדי לאסוף את התאים המתים. טריפסין התאים חסיד כפי שתואר בעבר ולאסוף את ההשעיה התא לתוך הצינור 15 מיליליטר המכיל את המדיום שנאסף.
צנטריפוגה ב 840 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שאף את supernatant ולהוסיף מיליליטר אחד של בינוני אחד או בינוני שתיים לספירת תאים. הכתם את ה- SP-CPCs בכחול טריפאן וספיר את התאים בני קיימא ומתים. ראשית, שאפו את המדיום מהתאים המוכנים, ושטוף אותם בעדינות בחמישה מיליליטר של HBSS חם.
לטפל בתאים עם חמישה מיליליטר של טריפסין EDTA במשך חמש דקות באינקובטור התא. לאחר מכן, להוסיף חמישה מיליליטר של בינוני אחד כדי לעצור את פעילות טריפסין. מעבירים את מתלי התא לצינור 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב 470 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
שאפו את העל-טבעי והוסיפו שניים בינוניים לספירת תאים. לאחר מכן, זרע 80, 000 תאים לתוך כל באר של צלחת תרבות מצופה מראש שש באר עם שלושה מיליליטר של בינוני שתיים. שמור את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 עד 24 שעות, ולאחר מכן לשנות את המדיום בכל באר לשלושה מיליליטר של בינוני שלוש.
תרבות הצלחת במשך 21 ימים, שינוי המדיום כל שלושה ימים. לאחר מכן, להכתים את התאים עם סמן אנדותל ולבצע מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאמת את האופי ה אנדותל של התאים המובחנים. ראשית, שאפו את המדיום מהתאים המוכנים ושטוף אותם בעדינות בחמישה מיליליטר של HBSS חם.
לטפל בתאים עם שני מיליליטר של טריפסין EDTA במשך חמש דקות באינקובטור התא, ולאחר מכן להוסיף שלושה מיליליטר של בינוני שלוש כדי לעצור את פעילות טריפסין. מעבירים את מתלי התא לצינור 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב 470 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את העל-טבעי והוסיפו מיליליטר אחד של מדיום 3, תוך כדי ערבוב עדין.
לספור את התאים ואת הזרע בין 2, 000 ו 4, 000 תאים ב 100 microliters של בינוני שלוש לכל מטריצה מצופה היטב של צלחת 96 באר. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ שדה בהיר בהגדלה פעמיים כדי לצלם את התאים.
במחקר זה, תנאים מתאימים נחקרים להקלה על מחויבות שושלת אנדותל של תאי לב. כאשר קונפלינציית התא היא ב- 60% או מתחת לה, לא נראה הבדל משמעותי בדגימות שטופלו ב- 3.5%FBS. כאשר תאים ב confluency זו מטופלים עם 0.1%FBS, הם מראים ירידה בהתפשטות התא על למינין בהשוואה פיברונאקטין, אבל לא מראים עלייה במוות התא.
לעומת זאת, תאים בקונפלות גבוהה מראים שאין הבדל משמעותי בהתפשטות התאים או במוות התאים בין שני התנאים. שינויים בצורת התא נראים כאינדיקטור לתנאי תרבות מתאימים שבהם דיפרנציאלי אנדותל הולך להיות מוצלח. בתוך שבעה עד 14 ימים במדיום דיפרנציאלי אנדותל, תרבויות מוצלחות נתפסות להכיל תאים גדולים יותר עם מורפולוגיה שונה.
באופן מעניין, תאים אלה נעלמו לקראת סוף שלב ההידול ונטה להופיע במספרים נמוכים יותר ובזמן מאוחר יותר מצביעים על תרבויות בצפיפות גבוהה. היווצרות צינור הוא מוצלח באופן עקבי בתאים מצופים בצפיפות נמוכה מובחן על למינין, בעוד הוא נראה בעיקר להיכשל בתאים מצופים בצפיפות גבוהה. בעוד היווצרות הצינור הוא בעיקר לא מוצלח בתאים מתורבתים על fibronectin ללא קשר לצפיפות התא, אלה מובחנים בצפיפות נמוכה לפעמים יוצרים צינורות בסיסיים.
ריכוז הסרום וצפיפות התאים כדי לגרום לשושלת אנדותל הם קריטיים, ויש להתאים אותם כדי להבטיח האטה של התפשטות תוך שמירה על הכדאיות. עם אינדוקציה שושלת, CPCs מבני אדם או מודלים מחלה פרה-קלינית עשוי לשמש עבור מחקרים השתלת תאים כדי להעריך את פוטנציאל ההידול in vivo שלהם. פרוטוקול זה יכול לעזור ללמוד או להקים כלי התחדשות לב חדשניים, והוא שימש בעבר לחקר מנגנון מולקולרי של מחויבות שושלת מוקדמת.
