増幅時の心臓前駆細胞(CPC)の分化には、増殖からコミットされた段階への相切り替えが必要であり、このプロトコルはCPCで効率的な内皮系を使用する。この技術の主な利点は、いくつかの技術に基づいて、異なる種から分離されたCPCに適用可能であるということです。このプロトコルは、細胞治療のためのCPCの治療可能性を高めるために使用することができる。
また、分化の可能性とメカニズムを調べ、これらが心臓病によってどのように影響を受けるかを調べることもできます。CPCは、形状、サイズ、および効力が異なる可能性がある細胞の不均一な集団です。したがって、プロトコルは、使用するCPCの特定のサブ人口に応じて調整する必要があります。
マウスを麻酔した後、70%エタノールで胸を拭き取ります。はさみを使用して、胸腔を露出させるために皮膚と胸壁を切断します。鉗子を使って心臓を持ち上げ、ハサミを使ってベースで切ります。
5ミリリットルの冷たいPBSを含むP60培養皿に心臓を移し、鉗子を使って心臓をポンピングし、空洞から血液を排出する。冷たいPBSの5ミリリットルを含むP60皿に心臓を置き、それを洗います。小さなはさみを使って心房を取り除き、心臓を2つの縦方向に切り、5ミリリットルの氷冷PBSで洗います。
小さいはさみを使って、心臓の部分を小さな切り分けに切ります。コラゲターゼBを含むハンクのバランスのとれた塩溶液を1ミリリットル当たり1ミリグラムの濃度で加え、滅菌カミソリブレードを使用して小さな心臓片を十分にミンチします。次に、2.5ミリリットルのコラゲターゼB溶液を皿に加えます。
30度の角度で、37度のインキュベーターに置きます。インキュベーション中に10分ごとにパスツールピペットを通して繰り返しそれらを渡しながら、最大30分間インキュベートするひき肉の部分をしてみましょう。まず、2%FBSを補った冷たいHBSSを5ミリリットル加え、細かく均質化された心臓片に加えます。
100マイクロメートルのフィルターを使用して、未消化の組織を除去するために心臓片をフィルター処理する。470倍Gで遠心分離機、室温で5分間。上清を捨て、5ミリリットルの赤血球のリシスバッファーでペレットを再中断します。
時折揺れで5分間氷の上でインキュベートします。この後、PBSを10ミリリットル加え、40マイクロメートルのフィルターを通してサンプルをフィルターし、残留心筋細胞を含むより大きな細胞を除外します。470倍Gで遠心分離機、休憩なしで5分間室温で。
その後、10%FBSを補ったDMEM中の細胞を再懸濁し、1ミリリットル当たり100万個の細胞の最終的な細胞濃度を目指す。染色と選別のために細胞を2つのチューブに分配し、1つのチューブに1.5ミリリットルの細胞溶液を加え、2番目のチューブに3.5ミリリットルを加えます。Hoechst溶液を加え、時折反転して摂氏37度で90分間インキュベートし、色素の均等な分配を確実にし、細胞の凝固を防ぎます。
側の人口は、主要な人口の脇のHoechst低い左下隅に表示されます。FACSプロットでは、ベラパミルがサイドの集団を消滅させる負のコントロールに基づいて識別することができます。中程度の1〜37度を温め、遠心分離機を摂氏4度に冷やします。
470倍Gで選別管を6分間摂氏4度で遠心分離します。次に、培地1で細胞を再懸濁する。培地1の4ミリリットルを含むガス透過性P60皿に細胞を移します。
細胞が各フラスコに8ミリリットルの培地1を使用してT75フラスコで2〜3日間、細胞が70〜80%の培養SP-CPCの合流点に達するまで、3日ごとに培地を変更します。次に、慎重に媒体を吸引し、温かいHBSSの5ミリリットルでフラスコを穏やかにすすります。5%の二酸化炭素で摂氏37度で5分間、5ミリリットルのトリプシンEDTAで細胞を治療します。
次いで、ミディアム1の5ミリリットルを加えてトリプシン活性を停止し、細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移した。室温で5分間Gの470倍の遠心分離機。次に、培地1または培地2のいずれかで細胞を再中断する。
P60皿に細胞をプレートし、異なる血清濃度を含む3ミリリットルの培地で1皿あたり250,000 SP-CPCをメッキします。培養の2日後、各皿から15ミリリットルのチューブに培地を集めて死んだ細胞を採取する。先に述べたように付着細胞をトリプシン化し、回収された培地を含む15ミリリットルのチューブに細胞懸濁液を集める。
840倍Gで室温で5分間遠心分離機を行い、その後上清を吸引し、セルカウント用に1または2個の培地を1ミリリットル加える。SP-CPCをトリパンブルーで染色し、生存可能な細胞と死んだ細胞を数えます。まず、調製した細胞から培地を吸引し、5ミリリットルの温かいHBSSで穏やかにすすいます。
5ミリリットルのトリプシンEDTAで細胞インキュベーターで5分間治療します。次に、5ミリリットルのミディアム1を加えてトリプシン活性を停止する。セル懸濁液を15ミリリットルチューブに移し、遠心分離機を470倍Gで室温で5分間移動します。
上清を吸引し、セルカウント用にミディアム2を加えます。次に、シード80,000細胞を、培地2の3ミリリットルを用いた事前コーティングされた6ウェル培養プレートの各ウェルに入る。プレートを摂氏37度に20~24時間置き、各ウェルの培地をミディアム3の3ミリリットルに変更します。
プレートを21日間培養し、3日ごとに培地を交換する。この後、細胞を内皮マーカーで染色し、蛍光顕微鏡を行い、分化した細胞の内皮性を検証する。まず、調製した細胞から培地を吸引し、5ミリリットルの温かいHBSSで穏やかにすすいます。
細胞インキュベーターで2ミリリットルのトリプシンEDTAを5分間処理し、3ミリリットルの培地を加えてトリプシン活性を停止します。セル懸濁液を15ミリリットルチューブに移し、遠心分離機を470倍Gで室温で5分間移動します。上清を吸引し、ミディアム3の1ミリリットルを加え、軽くピペットして混ぜます。
96ウェルプレートのウェルをコーティングした各マトリックスに培地3の100マイクロリットルの2,000と4,000の細胞と種子の間の細胞および種子を数える。プレートを摂氏37度で16時間インキュベートします。この後、2倍倍の明視野顕微鏡を使用して細胞の写真を撮ります。
本研究では、心臓前駆細胞の内皮系統コミットメントの促進のために適切な条件が検討される。細胞の合流率が60%以下の場合、3.5%FBSで処理したサンプルに有意差は見られない。この合流の細胞を0.1%FBSで処理すると、フィブロネクチンと比較するとラミニンの細胞増殖が減少するが、細胞死の増加は示さない。
対照的に、高い合流度の細胞は、2つの条件間の細胞増殖または細胞死のいずれにも有意な差を示さない。細胞形状の変化は、内皮分化が成功する適切な培養条件の指標であるように見える。内皮分化培地において7~14日以内に、異なる形態を有する大きな細胞を含む培養が成功することが分かる。
興味深いことに、これらの細胞は分化段階の終わりに向かって消失し、高密度培養においてより低い数および後の時点で出現する傾向があった。チューブ形成は、低密度でめっきし、ラミニンで分化した細胞で一貫して成功していますが、高密度でメッキされた細胞ではほとんど失敗することが見られます。チューブ形成は、細胞密度に関係なくフィブロネクチン上で培養された細胞ではほとんど失敗するが、低密度で分化したものは初歩的なチューブを形成することがある。
内皮系統を誘導する血清濃度と細胞密度は非常に重要であり、生存率を維持しながら増殖の減速を保証するように調整する必要があります。系統誘導の際に、ヒトまたは前臨床疾患モデルからのCPCを細胞移植研究に使用して生体内分化の可能性を評価することができる。このプロトコルは、新しい心臓再生ツールの研究や確立に役立つ可能性があり、以前は初期の系統コミットメントの分子メカニズムを研究するために使用されていました。
