A diferenciação de células progenitoras cardíacas, ou CPCs, após a amplificação requer uma mudança de fase de uma proliferação para um estágio comprometido, e este protocolo utiliza uma linhagem endotelial eficiente em CPCs. Uma grande vantagem da técnica é que ela é aplicável a CPCs isolados com base em várias técnicas e de diferentes espécies. Este protocolo pode ser usado para melhorar os potenciais terapêuticos dos CPCs para terapia celular.
Também pode ser usado para investigar os potenciais e mecanismos de diferenciação e como estes são afetados por doenças cardíacas. Os CPCs são uma população inhomogênea de células que podem diferir em forma, tamanho e potência. Portanto, o protocolo deve ser ajustado de acordo com a subpopulação específica dos CPCs utilizados.
Depois de anestesiar o mouse, limpe o peito com 70% de etanol. Usando uma tesoura, corte a pele e a parede torácica para expor a cavidade torácica. Use fórceps para levantar o coração e use uma tesoura para cortá-lo na base.
Transfira o coração para um prato de cultura P60 contendo cinco mililitros de PBS frio, e então use fórceps para bombear o coração e ejetar o sangue para fora das cavidades. Coloque o coração em um prato P60 contendo cinco mililitros de PBS frio e lave-o. Use uma tesoura pequena para remover a atria, corte o coração em dois pedaços longitudinais e lave-os em cinco mililitros de PBS gelado.
Usando uma tesoura pequena, corte os pedaços do coração em seções menores. Adicione uma gota da solução de sal balanceada de Hank contendo colagenase B a uma concentração de um miligrama por mililitro, e use uma lâmina de barbear estéril para picar bem as pequenas peças do coração. Em seguida, adicione 2,5 mililitros da solução de colagenase B ao prato.
Coloque o prato em um ângulo de 30 graus em uma incubadora a 37 graus Celsius. Deixe as peças de coração picadas incubarem por um máximo de 30 minutos enquanto passam repetidamente por uma pipeta Pasteur a cada 10 minutos durante a incubação. Primeiro, adicione cinco mililitros de HBSS frio suplementado com 2% de FBS às peças cardíacas picadas e homogeneizadas.
Usando um filtro de 100 micrômetros, filtre as peças do coração para remover qualquer tecido não digerido. Centrifugar a 470 vezes G e à temperatura ambiente por cinco minutos. Descarte o supernasciente e suspenda a pelota em cinco mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos.
Incubar no gelo por cinco minutos com agitação ocasional. Depois disso, adicione 10 mililitros de PBS e filtre a amostra através de um filtro de 40 micrômetros para excluir células maiores, incluindo cardiomiócitos residuais. Centrifugar a 470 vezes G e à temperatura ambiente por cinco minutos sem o intervalo.
Em seguida, suspenda novamente as células em DMEM suplementadas com 10% de FBS, visando uma concentração celular final de um milhão de células por mililitro. Distribua as células em dois tubos para coloração e triagem, adicionando 1,5 mililitros da solução celular a um tubo e 3,5 mililitros ao segundo tubo. Adicione a solução Hoechst e incubar a 37 graus Celsius por 90 minutos com inversão ocasional para garantir a distribuição igual do corante e evitar a coagulação das células.
A população lateral aparece no canto inferior esquerdo hoechst, além da população principal. No enredo FACS pode ser identificado com base no controle negativo no qual verapamil leva a população lateral a desaparecer. Aqueça médio de 1 a 37 graus Celsius e esfrie a centrífuga a quatro graus Celsius.
Centrifugar os tubos de triagem a 470 vezes G e a 4 graus Celsius por seis minutos. Em seguida, suspenda novamente as células em média. Transfira as células para um prato P60 permeável a gás contendo quatro mililitros de médio.
Troque o meio a cada três dias até que as células alcancem uma confluência entre 70 e 80% SP-CPCs de cultura por dois a três dias em frascos T75 usando oito mililitros de médio em cada frasco. Em seguida, aspire cuidadosamente o médio e enxágue suavemente o frasco com cinco mililitros de HBSS quente. Trate as células com cinco mililitros de trippsina EDTA por cinco minutos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Em seguida, adicione cinco mililitros de médio para parar a atividade de trippsina e transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros. Centrifugar a 470 vezes G por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, suspenda as células em um médio ou médio dois.
Prato as células em pratos P60, emplacando 250,000 SP-CPCs por prato com três mililitros de médio contendo diferentes concentrações de soro. Após dois dias de cultivo, colete o meio de cada prato em um tubo de 15 mililitros para coletar as células mortas. Tentepsinizar as células aderentes como descrito anteriormente e coletar a suspensão celular no tubo de 15 mililitros que contém o meio coletado.
Centrifugar a 840 vezes G durante cinco minutos em temperatura ambiente, em seguida, aspirar o supernasce e adicionar um mililitro de um médio ou médio dois para a contagem celular. Manche os SP-CPCs com azul trypan e conte as células viáveis e mortas. Primeiro, aspire o meio das células preparadas e enxágue-as suavemente com cinco mililitros de HBSS quentes.
Trate as células com cinco mililitros de trippsina EDTA por cinco minutos na incubadora celular. Em seguida, adicione cinco mililitros de médio para parar a atividade de trippsina. Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros e centrífuga a 470 vezes G durante cinco minutos em temperatura ambiente.
Aspire o supernasce e adicione dois médios para a contagem de células. Em seguida, sementes 80.000 células em cada poço de uma placa de cultura pré-revestida de seis poços com três mililitros de dois médios. Mantenha a placa a 37 graus Celsius por 20 a 24 horas e troque o meio em cada poço para três mililitros de três médios.
Cultura da placa por 21 dias, mudando o meio a cada três dias. Depois disso, colori as células com um marcador endotelial e realize microscopia de fluorescência para verificar a natureza endielial das células diferenciadas. Primeiro, aspire o meio das células preparadas e enxágue-as suavemente com cinco mililitros de HBSS quentes.
Trate as células com dois mililitros de trippsina EDTA por cinco minutos na incubadora celular e adicione três mililitros de três médios para parar a atividade de trippsina. Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros e centrífuga a 470 vezes G durante cinco minutos em temperatura ambiente. Aspire o supernatante e adicione um mililitro de três médios, pipetando suavemente para misturar.
Conte as células e sementes entre 2.000 e 4.000 células em 100 microliters de três a cada matriz revestida bem de uma placa de 96 poços. Incubar a placa a 37 graus Celsius por 16 horas. Depois disso, use um microscópio de campo brilhante em duas vezes a ampliação para tirar uma foto das células.
Neste estudo, são exploradas condições adequadas para a facilitação do comprometimento da linhagem endotelial das células progenitoras cardíacas. Quando a confluência celular está em ou abaixo de 60% não é observada diferença significativa nas amostras tratadas com 3,5% de FBS. Quando as células dessa confluência são tratadas com 0,1% FBS, elas mostram uma diminuição na proliferação celular em laminina quando comparadas à fibronectina, mas não mostram aumento na morte celular.
Em contraste, as células em alta confluência não mostram diferença significativa na proliferação celular ou morte celular entre as duas condições. Mudanças na forma celular parecem ser um indicador de condições de cultura adequadas nas quais a diferenciação endotelial será bem sucedida. Dentro de sete a 14 dias no meio de diferenciação endotelial, culturas bem sucedidas são vistas para conter células maiores com diferentes morfologia.
Curiosamente, essas células desapareceram no final da fase de diferenciação e tendiam a aparecer em números mais baixos e em momentos posteriores em culturas de alta densidade. A formação de tubos é consistentemente bem sucedida em células banhadas em baixa densidade e diferenciadas em laminina, enquanto é vista como falha principalmente em células banhadas em alta densidade. Embora a formação de tubos seja em sua maioria mal sucedida em células cultivadas em fibronectina, independentemente da densidade celular, aquelas diferenciadas em baixa densidade às vezes formam tubos rudimentares.
A concentração sérica e a densidade celular para induzir a linhagem endotelial são cruciais, e elas têm que ser ajustadas para garantir a desaceleração da proliferação, mantendo a viabilidade. Após a indução de linhagem, cpcs de humanos ou modelos de doenças pré-clínicas podem ser usados para estudos de transplante celular para avaliar seu potencial de diferenciação in vivo. Este protocolo poderia ajudar a estudar ou estabelecer novas ferramentas de regeneração cardíaca, e foi anteriormente usado para estudar mecanismo molecular de comprometimento de linhagem precoce.
