Die Differenzierung von Kardialvorläuferzellen oder CPCs bei der Amplifikation erfordert einen Phasenwechsel von einer Vermehrung in ein festgeschriebenes Stadium, und dieses Protokoll verwendet eine effiziente endotheliale Abstammung in CPCs. Ein großer Vorteil der Technik besteht darin, dass sie auf CPCs anwendbar ist, die auf der Grundlage verschiedener Techniken und verschiedener Arten isoliert sind. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die therapeutischen Potenziale von CPCs für die Zelltherapie zu verbessern.
Es kann auch verwendet werden, um die Potenziale und Mechanismen der Differenzierung zu untersuchen und wie diese von Herzerkrankungen betroffen sind. CPCs sind eine inhomogene Population von Zellen, die sich in Form, Größe und Potenz unterscheiden können. Daher muss das Protokoll entsprechend der spezifischen Teilpopulation der verwendeten CPCs angepasst werden.
Nach der Anästhesisierung der Maus, wischen Sie seine Brust mit 70%Ethanol. Schneiden Sie mit einer Schere die Haut und die Brustwand, um die Brusthöhle freizulegen. Verwenden Sie Zangen, um das Herz zu heben, und verwenden Sie dann eine Schere, um es an der Basis zu schneiden.
Übertragen Sie das Herz auf eine P60-Kulturschale mit fünf Millilitern kalter PBS, und verwenden Sie dann Zangen, um das Herz zu pumpen und das Blut aus den Hohlräumen auszustoßen. Legen Sie das Herz in eine P60-Schale mit fünf Millilitern kalten PBS und waschen Sie es. Verwenden Sie eine kleine Schere, um die Vorhöfe zu entfernen, schneiden Sie das Herz in zwei Längsstücke und waschen Sie sie in fünf Milliliter eiskalte PBS.
Schneiden Sie die Herzteile mit einer kleinen Schere in kleinere Abschnitte. Fügen Sie einen Tropfen einer ausgewogenen Salzlösung von Hank, die Kollagennase B in einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter enthält, und verwenden Sie eine sterile Rasierklinge, um die kleinen Herzstücke gründlich zu zerkleinern. Als nächstes fügen Sie 2,5 Milliliter der Kollagenase B-Lösung in die Schale.
Legen Sie das Gericht in einem 30-Grad-Winkel in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius. Lassen Sie die gehackten Herzstücke für maximal 30 Minuten brüten, während sie während der Inkubation alle 10 Minuten durch eine PasteurPipette passieren. Zuerst fügen Sie fünf Milliliter kalte HBSS, ergänzt mit 2%FBS, zu den gehackten und homogenisierten Herzstücken hinzu.
Filtern Sie die Herzteile mit einem 100-Mikrometer-Filter, um unverdautes Gewebe zu entfernen. Zentrifuge bei 470 mal G und bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in fünf Millilitern roter Blutkörperchen-Lysepuffer wieder auf.
Fünf Minuten auf Eis mit gelegentlichem Schütteln bebrüten. Danach fügen Sie 10 Milliliter PBS hinzu und filtern Sie die Probe durch einen 40-Mikrometer-Filter, um größere Zellen einschließlich Restkardiomyozyten auszuschließen. Zentrifuge bei 470 mal G und bei Raumtemperatur für fünf Minuten ohne Pause.
Dann, Re-Suspend die Zellen in DMEM mit 10%FBS ergänzt, mit dem Ziel einer endgültigen Zellkonzentration von einer Million Zellen pro Milliliter. Verteilen Sie die Zellen in zwei Röhren für die Färbung und Sortierung, indem Sie 1,5 Milliliter der Zelllösung zu einem Rohr und 3,5 Milliliter zum zweiten Rohr hinzufügen. Fügen Sie Hoechst-Lösung hinzu und brüten Sie bei 37 Grad Celsius für 90 Minuten mit gelegentlichem Kippen, um eine gleichmäßige Verteilung des Farbstoffs zu gewährleisten und eine Gerinnung der Zellen zu verhindern.
Die Seitenbevölkerung erscheint an der unteren linken Ecke von Hoechst neben der Hauptbevölkerung. Im FACS-Plot kann es anhand der negativen Kontrolle identifiziert werden, in der verapamil die Seitenpopulation zum Verschwinden auffordert. Erwärmen Sie mittlere ein bis 37 Grad Celsius und kühlen Sie die Zentrifuge auf vier Grad Celsius ab.
Zentrifugieren Sie die Sortierrohre bei 470 mal G und bei vier Grad Celsius für sechs Minuten. Setzen Sie dann die Zellen in Medium 1 erneut aus. Übertragen Sie die Zellen auf eine gasdurchlässige P60-Schale, die vier Milliliter Medium eins enthält.
Ändern Sie das Medium alle drei Tage, bis die Zellen einen Zusammenfluss zwischen 70 und 80% Kultur-SP-CPCs für zwei bis drei Tage in T75-Flaschen erreicht haben, wobei acht Milliliter Medium eins in jedem Kolben verwendet werden. Als nächstes das Medium vorsichtig ansaugen und den Kolben vorsichtig mit fünf Millilitern warmer HBSS abspülen. Behandeln Sie die Zellen mit fünf Milliliter Natschnass edTA fünf Minuten bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.
Fügen Sie dann fünf Milliliter Medium eins hinzu, um die Trypsin-Aktivität zu stoppen, und übertragen Sie die Zellsuspension in eine 15-Milliliter-Röhre. Zentrifuge bei 470 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Als Nächstes setzen Sie die Zellen in mittleren zwei oder mittleren zwei wieder aus.
Die Zellen auf P60-Schalen, beschichtungen 250, 000 SP-CPCs pro Schale mit drei Millilitern Medium mit unterschiedlichen Serumkonzentrationen. Nach zwei Tagen der Kultivierung, sammeln Sie das Medium aus jeder Schale in eine 15 Milliliter Tube, um die abgestorbenen Zellen zu sammeln. Trypsinize die anhaftenden Zellen wie zuvor beschrieben und sammeln Sie die Zellsuspension in die 15 Milliliter Tube, die das gesammelte Medium enthält.
Zentrifuge bei 840 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur, dann den Überstand aspirieren und einen Milliliter entweder mittlere ein oder mittlere zwei für die Zellzählung hinzufügen. Stain die SP-CPCs mit Trypan blau und zählen Sie die lebensfähigen und abgestorbenen Zellen. Zuerst das Medium aus den vorbereiteten Zellen ansaugen und mit fünf Millilitern warmer HBSS sanft abspülen.
Behandeln Sie die Zellen mit fünf Milliliter Trypsin EDTA für fünf Minuten im Zellinkubator. Fügen Sie dann fünf Milliliter Medium eins hinzu, um die Trypsin-Aktivität zu stoppen. Übertragen Sie die Zellsuspension bei raumhohen Temperaturen fünf Minuten lang in ein 15-Milliliter-Rohr und eine Zentrifuge bei 470-fachm G.
Aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie Medium zwei für die Zellzählung hinzu. Als nächstes säen Sie 80.000 Zellen in jeden Brunnen einer vorbeschichteten Sechs-Brunnen-Kulturplatte mit drei Millilitern mittlerer zwei. Halten Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 20 bis 24 Stunden, und ändern Sie dann das Medium in jedem Brunnen auf drei Milliliter medium drei.
Kultur die Platte für 21 Tage, das Medium alle drei Tage wechseln. Danach färben Sie die Zellen mit einem endotheliale Marker und führen Sie Fluoreszenzmikroskopie durch, um die endotheliale Natur der differenzierten Zellen zu überprüfen. Zuerst das Medium aus den vorbereiteten Zellen ansaugen und mit fünf Millilitern warmer HBSS sanft abspülen.
Behandeln Sie die Zellen mit zwei Milliliter Trypsin EDTA für fünf Minuten im Zellinkubator, dann fügen Sie drei Milliliter Medium drei hinzu, um die Trypsin-Aktivität zu stoppen. Übertragen Sie die Zellsuspension bei raumhohen Temperaturen fünf Minuten lang in ein 15-Milliliter-Rohr und eine Zentrifuge bei 470-fachm G. Aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie einen Milliliter Medium drei, Pipettieren sanft zu mischen.
Zählen Sie die Zellen und Samen zwischen 2 000 und 4 000 Zellen in 100 Mikrolitern des Mediums drei zu jeder Matrix, die gut mit einer 96-Well-Platte beschichtet ist. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 16 Stunden. Verwenden Sie anschließend ein Hellfeldmikroskop bei der zweifachen Vergrößerung, um ein Bild der Zellen zu machen.
In dieser Studie werden geeignete Bedingungen für die Erleichterung der endotheliaalen Abstammung Engagement von Herzvorläuferzellen untersucht. Wenn die Zellkonfluency bei oder unter 60% liegt, ist kein signifikanter Unterschied in den proben gesehen, die mit 3,5%FBS behandelt wurden. Wenn Zellen in dieser Konfluenz mit 0,1%FBS behandelt werden, zeigen sie eine Abnahme der Zellproliferation auf Laminin im Vergleich zu Fibronectin, zeigen aber keine Zunahme des Zelltodes.
Im Gegensatz dazu zeigen Zellen mit hoher Konfluenz keinen signifikanten Unterschied in der Zellproliferation oder dem Zelltod zwischen den beiden Bedingungen. Veränderungen in der Zellform scheinen ein Indikator für geeignete Kulturbedingungen zu sein, in denen die endotheliale Differenzierung erfolgreich sein wird. Innerhalb von sieben bis 14 Tagen im endotheliaalen Differenzierungsmedium werden erfolgreiche Kulturen gesehen, die größere Zellen mit unterschiedlicher Morphologie enthalten.
Interessanterweise verschwanden diese Zellen gegen Ende der Differenzierungsphase und neigten dazu, in niedrigeren Zahlen und später in Kulturen mit hoher Dichte zu erscheinen. Die Rohrbildung ist durchweg erfolgreich in Zellen, die mit geringer Dichte plattiert und auf Laminin differenziert sind, während sie in Zellen, die mit hoher Dichte plattiert sind, meist versagen. Während die Rohrbildung in Zellen, die unabhängig von der Zelldichte auf Fibronectin kultiviert werden, meist erfolglos ist, bilden die bei geringer Dichte differenzierten manchmal rudimentäre Röhren.
Die Serumkonzentration und die Zelldichte, um endotheliale Abstammung zu induzieren, sind von entscheidender Bedeutung, und sie müssen angepasst werden, um eine Verlangsamung der Proliferation bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit zu gewährleisten. Bei der Lineage-Induktion können CPCs von Menschen oder präklinische Krankheitsmodelle für Zelltransplantationsstudien verwendet werden, um ihr In-vivo-Differenzierungspotenzial zu bewerten. Dieses Protokoll könnte helfen, neue Herzregenerationswerkzeuge zu studieren oder zu etablieren, und es wurde zuvor verwendet, um molekulare Mechanismen der frühen Abstammung Sitte zu untersuchen.
