إن التمييز بين خلايا السلف القلبي، أو الممارسات الكيميائية، عند التضخيم يتطلب التحول من مرحلة الانتشار إلى مرحلة ملتزمة، ويستخدم هذا البروتوكول نسباً بطانةياً فعالاً في الممارسات الكيميائية. ومن المزايا الرئيسية لهذه التقنية أنها تنطبق على الـ CPCs المعزولة بناء على عدة تقنيات ومن أنواع مختلفة. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتعزيز الإمكانات العلاجية لـ CPCs للعلاج الخلوي.
ويمكن أيضا أن تستخدم لدراسة إمكانات وآليات التمايز وكيفية تأثر هذه الأمراض بمرض القلب. CPCs هي مجموعة غير متجانسة من الخلايا التي قد تختلف في الشكل والحجم، والفعالية. ولذلك، يجب تعديل البروتوكول وفقاً للاكتظاظ الفرعي المحدد لـ CPCs المستخدم.
بعد تخدير الماوس، مسح أسفل صدره مع الإيثانول 70٪. باستخدام مقص، وقطع الجلد وجدار الصدر لفضح تجويف الصدر. استخدام ملقط لرفع القلب، ومن ثم استخدام مقص لقطع عليه في القاعدة.
نقل القلب إلى طبق ثقافة P60 تحتوي على خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة، ومن ثم استخدام ملقط لضخ القلب وإخراج الدم من التجاويف. ضع القلب في طبق P60 يحتوي على خمسة ملليلتر من PBS البارد واغسله. استخدام مقص صغير لإزالة الأذين، وقطع القلب إلى قطعتين طولية، وغسلها في خمسة ملليلتر من الجليد البارد برنامج تلفزيوني.
باستخدام مقص صغير، وقطع قطع القلب إلى أقسام أصغر. أضف قطرة من محلول الملح المتوازن من هانك الذي يحتوي على الكولاجيناز B بتركيز واحد ملليغرام لكل ملليلتر، واستخدم شفرة حلاقة معقمة لتمرم قطع القلب الصغيرة بدقة. بعد ذلك، أضف 2.5 ملليلتر من محلول الكولاجيناز B إلى الطبق.
ضع الطبق بزاوية 30 درجة في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. دع قطع القلب المفروم تحتضن لمدة أقصاها 30 دقيقة أثناء تمريرها مرارًا وتكرارًا من خلال ماصة باستور كل 10 دقائق أثناء الحضانة. أولا، إضافة خمسة ملليلتر من HBSS الباردة تكملها 2٪ FBS لقطع القلب المفروم ومتجانسة.
باستخدام مرشح 100 ميكرومتر، تصفية قطع القلب لإزالة أي أنسجة غير مهضومة. جهاز طرد مركزي في 470 مرة G وفي درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من خلايا الدم الحمراء العازلة.
احتضان على الجليد لمدة خمس دقائق مع اهتزاز في بعض الأحيان. بعد ذلك، إضافة 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني وتصفية العينة من خلال مرشح 40 ميكرومتر لاستبعاد الخلايا الأكبر بما في ذلك خلايا القلب المتبقية. جهاز طرد مركزي في 470 مرة G وفي درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق دون كسر.
ثم، إعادة تعليق الخلايا في DMEM تكملها مع 10٪ FBS، تهدف إلى تركيز الخلية النهائية من مليون خلية لكل ملليلتر. توزيع الخلايا في أنبوبين لتلطيخ وفرز، مضيفا 1.5 ملليلتر من حل الخلية إلى أنبوب واحد و 3.5 ملليلتر إلى الأنبوب الثاني. إضافة حل Hoechst واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة مع التقليب في بعض الأحيان لضمان توزيع متساو للصبغة ومنع تخثر الخلايا.
يظهر الالسّكان جانبيّة في ال أدنىّ هويشّت ركن يسرى جانبا من الالسّكان رئيسيّة. في مؤامرة FACS يمكن تحديدها على أساس السيطرة السلبية التي فيراباميل يدفع السكان الجانب إلى تختفي. الاحماء المتوسطة واحد إلى 37 درجة مئوية وتبرد جهاز الطرد المركزي إلى أربع درجات مئوية.
أجهزة الطرد المركزي أنابيب الفرز في 470 مرة G و4 درجات مئوية لمدة ست دقائق. ثم، إعادة تعليق الخلايا في واحد المتوسطة. نقل الخلايا إلى طبق P60 الغاز نفاذية تحتوي على أربعة ملليلتر من واحد متوسطة.
تغيير المتوسطة كل ثلاثة أيام حتى الخلايا قد وصلت إلى التقاء بين 70 و 80٪ الثقافة SP-CPCs لمدة يومين إلى ثلاثة أيام في قارورة T75 باستخدام ثمانية ملليلترات من واحد متوسطة في كل قارورة. المقبل، بعناية الطامح المتوسطة وشطف بلطف قارورة مع خمسة ملليلتر من HBSS دافئة. علاج الخلايا مع خمسة ملليلتر من التربسين EDTA لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
ثم، إضافة خمسة ملليلتر من واحد متوسطة لوقف نشاط التربسين، ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر. جهاز طرد مركزي عند 470 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، إعادة تعليق الخلايا في متوسطة واحدة أو اثنين متوسطة.
لوحة الخلايا على أطباق P60، والطلاء 250، 000 SP-CPCs في الطبق مع ثلاثة ملليلتر من المتوسط تحتوي على تركيزات مصل مختلفة. بعد يومين من الاستزراع، اجمع المتوسط من كل طبق إلى أنبوب 15 ملليلتر لجمع الخلايا الميتة. تبسينيزي الخلايا الملتصية كما سبق وصفها وجمع تعليق الخلية في أنبوب 15 ملليلتر الذي يحتوي على المتوسطة التي تم جمعها.
جهاز طرد مركزي في 840 مرات G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم pirate عظمى وإضافة ملليلتر واحد إما متوسطة واحدة أو متوسطة اثنين لعد الخلايا. وصمة عار SP-CPCs مع الأزرق trypan عد الخلايا القابلة للحياة والميتة. أولاً، استلهم الوسط من الخلايا المعدة، وشطفها بلطف بخمسة ملليلترات من HBSS الدافئة.
علاج الخلايا مع خمسة ملليلتر من التربسين EDTA لمدة خمس دقائق في حاضنة الخلية. ثم، إضافة خمسة ملليلتر من واحد متوسطة لوقف نشاط التربسين. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر والطرد المركزي في 470 مرات G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
استلهمت من فوق ونضيف متوسطتين لعد الخلايا. بعد ذلك ، بذور 80000 خلية في كل بئر من لوحة ثقافة ستة جيدا المغلفة مسبقا مع ثلاثة ملليلتر من اثنين المتوسطة. الحفاظ على لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 20 إلى 24 ساعة، ومن ثم تغيير المتوسطة في كل بئر إلى ثلاثة ملليلتر من ثلاثة متوسطة.
ثقافة لوحة لمدة 21 يوما، وتغيير الوسط كل ثلاثة أيام. بعد ذلك، وصمة عار الخلايا مع علامة البطانية وإجراء المجهر الفلورية للتحقق من طبيعة البطانية من الخلايا المتمايزة. أولاً، pirate المتوسطة من الخلايا المعدة وشطفها بلطف مع خمسة ملليلتر من HBSS الحارة.
علاج الخلايا مع مليلتر اثنين من تريبسين EDTA لمدة خمس دقائق في حاضنة الخلية، ثم إضافة ثلاثة ملليلترات من ثلاثة المتوسطة لوقف نشاط التربسين. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر والطرد المركزي في 470 مرات G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. التعرق و إضافة ملليلتر واحد من ثلاثة متوسطة، pipetting بلطف لخلط.
عد الخلايا والبذور بين 2،000 و 4،000 الخلايا في 100 ميكروليتر من ثلاثة المتوسطة لكل مصفوفة المغلفة جيدا من لوحة 96-جيدا. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. بعد ذلك، استخدم مجهرًا مشرقًا في التكبير مرتين لالتقاط صورة للخلايا.
في هذه الدراسة، يتم استكشاف ظروف مناسبة لتسهيل التزام النسب البطاني للخلايا السلف القلبية. عندما يكون التقاء الخلية عند أو أقل من 60٪ لا يظهر فرق كبير في العينات المعالجة بنسبة 3.5٪FBS. عندما يتم التعامل مع الخلايا في هذا الالتقاء مع 0.1٪ FBS, أنها تظهر انخفاضا في انتشار الخلايا على اللامينيين بالمقارنة مع فيبرومينكتين, ولكن تظهر أي زيادة في موت الخلايا.
وعلى النقيض من ذلك، لا تظهر الخلايا في التقاء عال أي فرق كبير في انتشار الخلايا أو موت الخلايا بين الشرطين. ويبدو أن التغيرات في شكل الخلية مؤشر على ظروف مناسبة لثقافة التمايز البطانية التي ستكون ناجحة فيها. في غضون سبعة إلى 14 يوما في وسط التمايز البطانية، وينظر إلى الثقافات الناجحة على أنها تحتوي على خلايا أكبر مع مورفولوجيا مختلفة.
ومن المثير للاهتمام أن هذه الخلايا اختفت في نهاية مرحلة التمايز وتميل إلى الظهور بأعداد أقل وفي وقت لاحق في الثقافات ذات الكثافة العالية. تكوين أنبوب هو ناجح باستمرار في الخلايا مطلية في كثافة منخفضة وتفاضلية على اللامينين، في حين أنه ينظر إلى أن تفشل في الغالب في الخلايا مطلية في كثافة عالية. في حين أن تكوين الأنبوب غير ناجح في الغالب في الخلايا المستزرعة على الليفية بغض النظر عن كثافة الخلايا ، فإن تلك التي تتمايز في كثافة منخفضة تشكل في بعض الأحيان أنابيب بدائية.
إن تركيز المصل وكثافة الخلايا للحث على النسب البطاني أمران حاسمان، ويجب تعديلهما لضمان إبطاء الانتشار مع الحفاظ على الاستمرارية. عند تحريض النسب، يمكن استخدام CPCs من البشر أو نماذج الأمراض قبل الإكلينيكية لدراسات زرع الخلايا لتقييم إمكاناتها في التمايز الجسم الحي. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في دراسة أو إنشاء أدوات تجديد قلب جديدة ، وكان يستخدم سابقًا لدراسة الآلية الجزيئية لالتزام النسب المبكر.
