转移性结直肠癌患者循环微 rna 自定义面板的检测

该方法有助于回答转化研究领域的一些关键问题，如循环生物标志物与患者预后的关系。该技术的主要优点是有机会评估循环生物标志物面板的表达，该方法简单可靠，投入材料量小。这种技术的影响延伸到癌症患者的治疗，因为它可以识别循环生物标志物，在患者的决策和治疗监测中有用。

此外，该方法还可以提供循环生物标志物分析的见解。它也可以应用于其他系统，如组织生物标志物表达分析，用于疾病的分子表征。此方法的可视化演示至关重要，因为提取步骤很难学习。

首先，将 400 微升的血浆样品转移到无 RNase 的两毫升管中。然后，在管中加入400微升变性溶液。添加四个微升的一纳米摩尔尖峰。

混合溶液后，加入800微升的酸酚-氯仿。旋转溶液60秒，以最大速度离心15分钟。接下来，将上水相中所含的利酸盐转移到干净的管中，注意不要干扰相间。

测量回收的水相的体积，并在酸盐中加入1/3体积的乙醇。然后，将滤芯放入新的收集管中。将多达 700 微升乙醇-分离混合物转移到滤芯中。

在重力为 10，000 倍时将滤芯离心 30 秒。接下来，测量流经的总量。然后，将2/3的乙醇体积加入过滤中，并混合好。

将第二个滤芯放入新的收集管中。然后，将多达 700 微升的样品转移到墨盒中，并在 10，000 倍重力下离心 30 秒，然后丢弃流经。在滤芯中加入700微升微RNA清洗溶液，并在10000倍重力下用收集管将其离心15秒。

丢弃流式，将滤芯放回同一管中。在此之后，将滤芯移动到新的收集管。然后，向墨盒添加 100 微升预热洗脱溶液。

将滤芯在重力为 10，000 倍的离心 30 秒，以回收微RNA。根据文本协议准备聚亚二聚二聚反应混合鸡尾酒。将样品的两微升转移到反应板的每个井中。

然后，在每井中加入三个反应鸡尾酒的微升。漩涡和离心板短暂旋转的内容。接下来，将板放在热循环器中，并遵循文本协议中概述的步骤。

在离心管中准备结扎反应混合鸡尾酒。接下来，在反应板的每个井中加入10微升的鸡尾酒。然后，在转速为 1，900 rpm 的摇床上混合反应板的内容，持续一分钟，然后短暂离心板。

在此之后，将反应板放在热循环器中，并遵循文本协议中概述的步骤。要执行逆转录反应，请根据文本协议在离心管中准备反应混合物。然后，在含有结扎产品的板的每个井中加入15微升混合物。

以 1，900 rpm 的转速将板的内容混合在摇床上一分钟，然后短暂离心机。接下来，将板放在热循环器中，并遵循文本协议中概述的步骤。然后，准备 miR-Amp 反应混合物，并在新反应板的每个井中加入 45 微升混合。

在此之后，在反应板的每个井中加入五微升RT产品。以 1，900 rpm 的转速将板混合在摇床上一分钟，然后短暂离心机。然后，将板放在热循环器中，并遵循文本协议表之一中概述的步骤。

首先，稀释TE缓冲液中的每个cDNA样品。然后，在离心管中准备PCR反应混合物。增加超过10%的体积。

将 19 微升的反应混合物转移到板的每个井中。密封板，并短暂离心。最后，在RT-PCR系统上执行热协议，如文本协议表2所示。

进行尖峰控制序列稀释，以选择在此特定案例系列的所有等离子体样品中添加的最佳浓度。得益于此协议，可以评估每个患者的所有生物标志物，以及整个病例系列中的单一生物标志物。在该协议中，对用化疗方案治疗的结直肠癌患者进行了与无进展生存、整体存活率和客观反应率相关的血管生成相关循环miRNA的小组分析。

比较基线和首次临床评价之间的miRNA表达水平，观察到有miR-155-5p的增加。这一增加与较短的PFS和操作系统有关。在尝试此过程时，重要的是要记住在烟罩下使用苯酚氯仿执行步骤。按照这个程序，可以执行其他方法，如分离和分析循环蛋白或编码RNA，以回答其他问题，如评估一个更详尽的循环生物标志物面板。

该技术开发后，为液体活检领域的研究人员探索癌症患者循环生物标志物的表达铺平了道路。不要忘记，使用血液和化学试剂可能极其危险，执行此程序时应始终采取手套和实验室外套等预防措施。