这种方法可以帮助回答免疫抑制治疗干预领域的关键问题，用于研究药物对组织再生的不利影响，特别是对骨骼的不利影响。这项技术的主要优点是，它结合了过去的斑马鱼骨再生模型与全身药物暴露，将受伤的斑马鱼浸入药物补充鱼水中。在开始手术之前，每只斑马鱼用一个铝箔覆盖600毫升烧杯和适当数量的鱼水玻璃瓶进行实验，并在感兴趣的实验控制解决方案中准备免疫抑制药物。
对于截肢伤害，使用钝钳小心地将麻醉的斑马鱼放在其侧侧 100 毫米 Petri 盘的内侧盖子上，并使用手术刀对 50% 的鳍进行修复。然后将鱼放入含有300毫升鱼水的自 <3> <3>化烧杯中，并辅以适当的实验剂，用铝箔盖住烧杯，防止斑马鱼逃跑。为了诱发鳍骨折损伤，在解剖显微镜下将麻醉斑马鱼放在其侧侧100毫米的加罗斯涂层培养皿中，然后将注射针稍微推入骨鳍射线段，直到出现裂纹。
重要的是，在鳍中引入不要太多的骨折，因为这可能会极大地损害稳定性。然后将鱼转移到含有300毫升鱼水的自用烧死嘴中，并辅以适当的实验剂。要产生钙化颅骨损伤，请将麻醉的斑马鱼放在直立位置，以便钙骨在解剖显微镜下很容易可视化。
将装有 500 微米钻头的旋转微钻头放在前骨中心，轻轻触摸骨骼，生成一个微型钻孔大小的孔。在产生损伤时不要横向移动钻头，一旦组织阻力下降，立即停止钻头至关重要。否则，大脑就会受损。
然后将鱼放入含有300毫升鱼水的自动捕获的烧杯中，并辅以适当的实验剂。每天将斑马鱼和鱼水转移到适当的临时容器中，用新鲜药物补充鱼水重新灌装烧杯，改变烧杯中的水。然后用鱼网将斑马鱼还到烧杯上。
对于总共持续两天的治疗，不要喂斑马鱼。在较长的实验过程中，每两天用0.5至1毫升孵化的阿提米亚SSP喂养斑马鱼。对于鳍伤害分析，收获细，并使用细钳抓住鱼翅在树桩的一个边缘。
使用第二对钳子抓住相反的树桩边缘，然后稍微将组织压在含有冷 4%PFA 的盘子底部 10 到 20 秒。根据需要重复鳍展平。鳍现在应该平放，没有卷曲。
对于固定后的长期样品储存，用三个20分钟的PBS洗涤和上升的甲醇系列清洗组织。然后，样品可以储存在零下20摄氏度的100%甲醇中。对于Alizarin Red染色，在降压甲醇系列中储存补水甲醇，随后在PBS中洗涤20分钟，在去维化水中清洗5分钟。
最后一次洗涤后，将Alizarin Red溶液加入样品组织，并在室温下用摇动孵育样品，以进行适当的染色期。要清除样品，用减少的1%氢氧化钾甘油系列处理组织。然后将样品储存在一对一的 0.1% 氢氧化钾溶液中，然后用 80% 甘油进行组织安装，以进行想象。
对于 Calcein 染色，在用铝箔覆盖的玻璃烧杯中同时孵育多达三条斑马鱼，在 100 毫米的钙素溶液中孵育 20 分钟。在孵化结束时，将斑马鱼转移到鱼水的容器中，让鱼短暂游泳，然后再将它们转移到鱼水的新容器中。在第二个烧杯20分钟后，获得鱼翅再生的实时图像，将麻醉斑马鱼放在一个加糖涂层的培养皿上，并通过立体显微镜对鳍进行成像。
要获取再生头骨的图像，请将斑马鱼直立在海绵中，然后通过荧光显微镜对头骨进行成像。与其他糖皮质激素类似，使用 Prednisolone 进行治疗，可对鳍再生进行整体抑制，包括由 Alizarin Red 染色的固定果鳍组织检测到的骨骼形成。同样，这种药物对颅骨损伤闭合有延迟作用。
由于免疫抑制，减少巨噬细胞数也可以通过冷冻组织部分的免疫组织化学检测，如使用抗mCherry和抗GFP抗体染色和转基因MPEG-1 mCherry与Osterix NGFP斑马鱼交叉在斑马鱼头骨组织样本从前尼索酮治疗的动物。在尝试这些程序时，重要的是通过以高度可重复的方式执行损伤论文，以尽量减少骨再生速度的变异性。在含有自体鱼水的自体嘴鱼中，单屋斑马鱼也至关重要，以避免微生物感染。
该协议将有助于进一步解决糖皮质激素作用的基本机制。例如，在糖皮质激素诱导骨质疏松症的背景下，也可以适用于其他药物和其他斑马鱼骨的使用。
