שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההתערבות הטיפולית בדיכוי המערכת החיסון לחקר ההשפעות השליליות של תרופות על התחדשות רקמות, בפרט, בעצמות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משלבת מודלים קודמים של התחדשות עצם זברה עם חשיפה מערכתית לתרופות על ידי טבילה של דג הזברה הפצוע במים דגים בתוספת סמים. לפני תחילת ההליך, autoclave רדיד אלומיניום אחד כיסה 600 מיליליטר לכל זברהפיש ומספר מתאים של בקבוקי זכוכית של מי דגים לניסוי ולהכין את התרופה לדיכוי המערכת החיסון בפתרונות בקרה ניסיוניים של עניין.
לפציעה של קטיעה, השתמש במטליות קהות כדי למקם בזהירות דג זברה הרדמה על צידו הצדדי על המכסה ההפוך של צלחת פטרי 100 מילימטר ולהשתמש באזמל כדי לכרות 50% מהסנפיר. לאחר מכן מניחים את הדג לתוך מקור autoclaved המכיל 300 מיליליטר של מי דגים בתוספת חומר ניסיוני מתאים לכסות את המזימה עם רדיד אלומיניום כדי למנוע בריחה זברה. כדי לגרום לפגיעה בשבר בסנפיר, מניחים דג זברה הרדמה בצד הצדדי שלו בצלחת פטרי מצופה 100 מילימטר מתחת למיקרוסקופ ניתוח ודחפו מחט הזרקה מעט לתוך קטע קרן סנפיר גרמי עד שיופיע סדק.
חשוב להכניס לא יותר מדי שברים לתוך הסנפיר כי זה עלול לפגוע מאוד ביציבות. ואז להעביר את הדג לתוך מקור autoclaved המכיל 300 מיליליטר של מי דגים בתוספת סוכן ניסיוני המתאים. כדי ליצור פגיעה בגולגולת, החזק דג זברה הרדמה במצב זקוף כך שהעצמות הגולגולתיות יתוארו בקלות תחת מיקרוסקופ ניתוח.
מניחים מקדחת מיקרו מסתובבת המצוידת במקדחה של 500 מיקרומטר מעל מרכז העצם הקדמית ונוגעים בעדינות בעצם כדי לייצר חור בגודל של המיקרו-מקדחה בר. זה קריטי לא להזיז את התרגיל באופן מאוחר יותר בעת הפקת הפציעה ולהפסיק מיד לאחר ההתנגדות של הרקמה טיפות. אחרת, המוח ייפגע.
ואז למקם את הדג לתוך מקור autoclaved המכיל 300 מיליליטר של מי דגים בתוספת סוכן ניסיוני המתאים. לשנות את המים בפקקים מדי יום על ידי העברת דג הזברה ומי הדגים לתוך מיכל זמני מתאים ומילוי המקור עם מי דגים בתוספת תרופה טרייה. לאחר מכן השתמש ברשת דגים כדי להחזיר את דג הזברה לסק שלה.
עבור טיפולים של עד יומיים בסך הכל, אין להאכיל את דג הזברה. במהלך ניסויים ארוכים יותר, להאכיל את הזברה עם 0.5 כדי מיליליטר אחד של ארטמיה SSP בקע בכל יום שני. לניתוח פציעות סנפיר, לקצור את הקנס ולהשתמש מדפים עדין לתפוס את הסנפיר בקצה אחד של הגדם.
השתמש זוג שני של מדפים כדי לתפוס את קצה הגדם הנגדי מעט לחץ על הרקמה על החלק התחתון של המנה המכילה קר 4% PFA במשך 10 עד 20 שניות. חזרו על שיטוח הסנפירים לפי הצורך. הסנפיר צריך עכשיו לשכב שטוח ללא קרלינג.
לאחסון מדגם לטווח ארוך לאחר קיבעון, לשטוף את הרקמה עם שלוש 20 דקות שטיפות PBS וסדרת מתנול עולה. לאחר מכן ניתן לאחסן את הדגימות ב-100% מתנול במינוס 20 מעלות צלזיוס. עבור כתמים אדומים Alizarin, rehydrate מתנול מאוחסן דגימות בסדרה מתנול יורד ואחריו שתי 20 דקות לשטוף PBS ואחד חמש דקות לשטוף במים deionized.
לאחר הכביסה האחרונה, מוסיפים פתרון אדום Alizarin לרקמת המדגם להדגירה את המדגם בטמפרטורת החדר עם נדנדה לתקופת הכתמים המתאימה. כדי לנקות את הדגימות, לטפל ברקמה עם ירידה של 1%אשלגן הידרוקסידי גליצרול סדרה. לאחר מכן לאחסן את הדגימות אחד לאחד 0.1% אשלגן הידרוקסיד כדי 80% גליצרול פתרון ולהוות את הרקמות עם 80% גליצרול לדמיון.
עבור ויטראז'ין Calcein, דגירה עד שלושה דגי זברה בו זמנית ב 100 מילימטרים של פתרון Calcein במשך 20 דקות ב זכוכית מכוסה רדיד אלומיניום. בסוף הדגירה, מעבירים את דג הזברה למכל מי דגים ותנו לדגים לשחות לזמן קצר לפני העברתם למכל חדש של מי דגים. לאחר 20 דקות בתוך הקוסם השני כדי לרכוש תמונות חיות של סנפיר מתחדש, מניחים דג זברה הרדמה על צלחת פטרי מצופה אגרוז ודמיין את הסנפיר על ידי מיקרוסקופיה סטריאו.
כדי לרכוש תמונות של עצמות הגולגולת המתחדשות, מניחים את דג הזברה זקוף בספוג ומדמים את הגולגולת במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. טיפול עם Prednisolone, בדומה glucocorticoids אחרים, מוביל עיכוב כולל של התחדשות הסנפיר כולל היווצרות העצם כפי שזוהה על ידי כתמים אדומים Alizarin של רקמת סנפיר קאודאלי קבוע. באופן דומה, לתרופה יש השפעה מעכבת על סגירת גולגולת גולגולת.
בשל דיכוי חיסוני, מספרי מקרופאג מופחתים יכולים גם להיות מזוהים על ידי אימונוהיסטוכימיה על מקטעי רקמה קפואים כפי שמוצג על ידי שימוש אנטי mCherry ו אנטי GFP יכתימות נוגדנים ו MPEG-1 mCherry מהונדס חצה עם Osterix NGFP זברפיש על דגימות רקמת הגולגולת Zebrafish מ בעלי חיים שטופלו Prednisolone. בעת ניסיון הליכים אלה חשוב למזער את השונות במהירות התחדשות העצם על ידי ביצוע מאמרי הפציעה בצורה ניתנת לשחזור מאוד. זה גם חיוני לבית יחיד זברה ב beakers autoclaved המכיל מי דגים autoclaved על מנת למנוע זיהום מיקרוביאלי.
פרוטוקול זה יעזור להמשיך לטפל במנגנונים הבסיסיים של פעולה glucocorticoid. לדוגמה, בהקשר של אוסטאופורוזיס המושרה glucocorticoid וייתכן גם להיות מותאם לשימוש בתרופות אחרות ועצם זברה אחרים.
