この方法は、特に骨の組織再生に対する薬物の悪影響を研究するための免疫抑制治療介入の分野における重要な質問に答えるのに役立つ。この技術の主な利点は、ゼブラフィッシュの骨再生の過去のモデルと、負傷したゼブラフィッシュを薬物補充魚水に浸漬させることによって全身薬物暴露と組み合わせることです。手順を開始する前に、1つのアルミニウム箔がゼブラフィッシュあたり600ミリリットルビーカーを覆い、実験のために魚の水のガラス瓶の適切な数をカバーし、目的の実験的制御溶液で免疫抑制薬を調製する。
切断傷害のために、鈍い鉗子を使用して、100ミリメートルのペトリ皿の逆蓋の側面に麻酔をかけたゼブラフィッシュを慎重に置き、メスを使ってフィンの50%を切断します。その後、適切な実験剤で補われた魚の水の300ミリリットルを含むオートクレーブビーカーに魚を置き、ゼブラフィッシュの脱出を防ぐためにホイルでビーカーをカバーします。フィン骨折の傷害を誘発するには、解剖顕微鏡の下でペトリ皿をコーティングした100ミリメートルアガロースの両側側に麻酔付きゼブラフィッシュを置き、ひびが現れるまで注射針を骨ひれの線セグメントにわずかに押し込みます。
これは、大幅に安定性を損なう可能性があるため、フィンにあまりにも多くの骨折を導入することが重要です。その後、適切な実験剤を補充魚水の300ミリリットルを含むオートクレーブビーカーに魚を転送します。カルバリアの頭蓋骨の損傷を生成するには、解剖顕微鏡の下でカルバリアの骨が容易に視覚化されるように、直立した位置に麻酔ゼブラフィッシュを保持します。
500マイクロメートルのドリルビットを備えた回転マイクロドリルを前頭骨の中央に配置し、骨にそっと触れてマイクロドリルバリの大きさの穴を作ります。損傷を生じながらドリルを横に動かせず、組織の抵抗力が低下したらすぐに停止することが重要です。さもなければ、脳は損傷を受ける。
その後、適切な実験剤を補充した魚の水の300ミリリットルを含むオートクレーブビーカーに魚を置きます。ゼブラフィッシュと魚の水を適切な一時的な容器に移し、新鮮な薬物補充魚の水でビーカーを補充することによって、ビーカーの水を毎日交換してください。その後、そのビーカーにゼブラフィッシュを返すために魚網を使用しています。
合計2日間持続する治療のために、ゼブラフィッシュを養わない。より長い実験の間に、ゼブラフィッシュに0.5〜1ミリリットルの孵化したアルテミアSSPを2日ごとに供給する。フィン傷害分析のために、細かいを収穫し、切り株の一端でフィンをつかむために細かい鉗子を使用する。
フォースプスの2番目のペアを使用して反対側の切り株の端をつかみ、冷たい4%PFAを含む皿の底にティッシュを10〜20秒間わずかに押し付けます。必要に応じてフィン平坦化を繰り返します。フィンは今カーリングなしで平らに横たわっているはずです。
固定後の長期サンプル貯蔵のために、3回の20分間のPBS洗浄と上昇メタノールシリーズで組織を洗浄します。サンプルは、マイナス20°Cで100%メタノールで保存することができます。アリザリンレッド染色の場合、メタノール貯蔵サンプルを降順メタノールシリーズに再水和し、続いてPBSで20分間の洗浄を行い、脱イオン水で5分間洗浄します。
最後の洗浄後、サンプル組織にアリザリンレッド溶液を加え、適切な染色期間に対してロッキングを使用して室温でサンプルをインキュベートします。サンプルをクリアするには、減少する1%水酸化グリセロール系列のカリウムで組織を治療します。その後、サンプルを1〜1~1%の水酸化カリウムに80%グリセロール溶液に保存し、80%グリセロールで組織を取り付けてイメージングします。
カルセイン染色の場合、100ミリメートルのカルセイン溶液で最大3匹のゼブラフィッシュを、アルミニウム箔で覆われたガラスビーカーに20分間同時にインキュベートします。インキュベーションの終わりに、ゼブラフィッシュを魚の水の容器に移し、魚を短時間泳いでから魚の水の新しい容器に移します。2番目のビーカーで20分後にフィン再生のライブ画像を取得し、アガロースコーティングされたペトリ皿の上に麻酔ゼブラフィッシュを置き、ステレオ顕微鏡でフィンを画像化します。
再生頭蓋骨の画像を取得するには、ゼブラフィッシュをスポンジに直立させ、蛍光顕微鏡で頭蓋骨を画像化します。プレドニゾロンによる治療, 他のグルココルチコイドと同様, 固定尾端のフィン組織のアリザリンレッド染色によって検出された骨形成を含むフィン再生の全体的な阻害につながります.同様に、薬物は、カルバリア頭蓋骨傷害閉鎖に対する遅延効果を有する。
免疫抑制により、抗mCherryおよび抗GFP抗体染色およびトランスジェニックMPEG-1 mCherryを使用して、プレドニゾロン処理動物のゼブラフィッシュ頭蓋骨組織サンプル上のオスリックスNGFPゼブラフィッシュと交差することによって証明されるように、凍結組織切片上の免疫組織化学によって減少したマクロファージ数を検出することもできる。これらの手順を試みている間、非常に再現性の高い方法で傷害エッセイを行うことによって、骨再生速度の変動を最小限に抑えることが重要である。また、微生物感染を避けるために、オートクレーブされた魚の水を含むオートクレーブビーカーの単一の家ゼブラフィッシュにとっても重要です。
このプロトコルは、グルココルチコイド作用の基礎となるメカニズムにさらに対処するのに役立ちます。例えば、グルココルチコイド誘発骨粗鬆症の文脈では、他の薬剤および他のゼブラフィッシュ骨の使用にも適応され得る。
