Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da intervenção terapêutica imunossupressor para estudar os efeitos adversos de drogas na regeneração tecidual, em particular, nos ossos. A principal vantagem desta técnica é que combina modelos passados de regeneração óssea de Zebrafish com exposição sistêmica de drogas pela imersão do zebrafish ferido na água de peixe suplementada. Antes de iniciar o procedimento, autoclave uma folha de alumínio coberta 600 mililitros por zebrafish e um número apropriado de garrafas de vidro de água de peixe para o experimento e preparar a droga imunossupressor em soluções de controle experimental de interesse.
Para uma lesão de amputação, use fórceps contundentes para colocar cuidadosamente um zebrafish anestesiado em seu lado lateral na tampa inversa de uma placa de Petri de 100 milímetros e use um bisturi para ressecar 50% da barbatana. Em seguida, coloque o peixe em um béquer autoclaved contendo 300 mililitros de água de peixe suplementado com agente experimental apropriado e cubra o béquer com papel alumínio para evitar a fuga de zebrafish. Para induzir uma lesão de fratura na barbatana, coloque um zebrafish anestesiado em seu lado lateral em uma placa de Petri revestida de 100 milímetros sob um microscópio dissecando e empurre uma agulha de injeção ligeiramente em um segmento de raio-barbatana óssea até que uma rachadura apareça.
É importante introduzir não muitas fraturas na barbatana, pois isso pode prejudicar muito a estabilidade. Em seguida, transfira o peixe para um béquer autoclaved contendo 300 mililitros de água de peixe complementado com o agente experimental apropriado. Para gerar uma lesão no crânio calvarial, segure um zebrafish anestesiado na posição vertical para que os ossos do calvário sejam facilmente visualizados sob um microscópio de dissecção.
Coloque uma micro broca rotativa equipada com uma broca de 500 micrômetros sobre o centro do osso frontal e toque suavemente no osso para produzir um orifício do tamanho da micro broca. É fundamental não mover a broca lateralmente durante a produção da lesão e parar imediatamente assim que a resistência do tecido cair. Caso contrário, o cérebro será danificado.
Em seguida, coloque o peixe em um béquer autoclaved contendo 300 mililitros de água de peixe complementada com o agente experimental apropriado. Troque a água nos béquers diariamente transferindo o zebrafish e a água dos peixes para um recipiente temporário apropriado e reabastecendo o béquer com água de peixe suplementada com drogas frescas. Em seguida, use uma rede de peixes para devolver o Zebrafish ao seu béquer.
Para tratamentos com duração de até dois dias no total, não alimente o Zebrafish. Durante experimentos mais longos, alimente o Zebrafish com 0,5 a um mililitro de Artemia SSP eclodida a cada dois dias. Para análise de lesões na barbatana, colhe a multa e use fórceps finos para agarrar a barbatana em uma borda do toco.
Use um segundo par de fórceps para pegar a borda oposta do toco e pressione ligeiramente o tecido na parte inferior do prato que contém pfa frio de 4% por 10 a 20 segundos. Repita o achatamento da barbatana conforme necessário. A barbatana deve agora ficar plana sem enrolar.
Para armazenamento de amostras de longo prazo após a fixação, lave o tecido com três lavagens pbs de 20 minutos e uma série ascendente de metanol. As amostras podem então ser armazenadas em 100% de metanol a menos 20 graus Celsius. Para a coloração alizarina vermelha, o metanol rehidrata armazenado amostras em uma série de metanol descendente seguido de duas lavagens de 20 minutos em PBS e uma lavagem de cinco minutos em água deionizada.
Após a última lavagem, adicione a solução Alizarin Red ao tecido amostral e incubar a amostra à temperatura ambiente com balanço para o período de coloração adequado. Para limpar as amostras, trate o tecido com a diminuição da série de glicerol de hidróxido de potássio de 1%. Em seguida, armazene as amostras em uma solução de hidróxido de potássio de 0,1% a 80% glicerol e monte os tecidos com 80% de glicerol para imaginar.
Para a coloração de Calcein, incubar até três zebrafish simultaneamente em 100 milímetros de solução calcein por 20 minutos em um béquer de vidro coberto com papel alumínio. No final da incubação, transfira o Zebrafish para um recipiente de água de peixe e deixe os peixes nadarem brevemente antes de transferi-los para um novo recipiente de água de peixe. Após 20 minutos no segundo béquer para adquirir imagens ao vivo de fin regenera, coloque um zebrafish anestesiado em uma placa de Petri revestida de agarose e imagem a barbatana por microscopia estéreo.
Para adquirir imagens dos ossos regeneradores do crânio, coloque o zebrafish em pé em uma esponja e imagem do crânio por microscopia de fluorescência. O tratamento com Prednisolona, semelhante a outros glicocorticoides, leva a uma inibição geral da regeneração de barbatanas, incluindo a formação óssea detectada pela mancha vermelha de Alizarin de tecido de barbatana caudal fixa. Da mesma forma, a droga tem efeito retardante no fechamento da lesão do crânio calvarial.
Devido à imunossupressão, números reduzidos de macrófagos também podem ser detectados por imunohistoquímica em seções de tecido congelado, como evidenciado pelo uso de manchas de anticorpos anti-mCherry e anti-GFP e mpeg-1 mCherry transgênicos cruzados com Osterix NGFP Zebrafish em amostras de tecido craniano zebrafish de animais tratados com Prednisolona. Ao tentar esses procedimentos, é importante minimizar a variabilidade na velocidade de regeneração óssea realizando os ensaios de lesão de forma altamente reprodutível. Também é crucial para a casa única zebrafish em béquers autoclaved contendo água de peixe autoclaved, a fim de evitar infecção microbiana.
Este protocolo ajudará a abordar ainda mais os mecanismos subjacentes da ação glicocorticoide. Por exemplo, no contexto da osteoporose induzida por glicocorticoide e também pode ser adaptada para o uso de outras drogas e outros ossos de zebrafish.
