Bu yöntem, ilaçların doku rejenerasyonu üzerindeki yan etkilerini incelemek için immünsupresif terapötik girişim alanındaki temel soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir, özellikle, kemiklerde. Bu tekniğin en büyük avantajı, ilaç takviyeli balık suyuna yaralı Zebrabalığı daldırma sistemik ilaç maruziyeti ile Zebrafish kemik rejenerasyonu geçmiş modelleri birleştirir olmasıdır. İşleme başlamadan önce, otoklav bir alüminyum folyo Zebrabalığı başına 600 mililitrelik beher ve deney için uygun sayıda cam şişe balık suyu kapladı ve ilgi deneysel kontrol çözümleri immünsupresif ilaç hazırlamak.
Bir ampütasyon yaralanması için, 100 milimetrelik Petri kabının ters kapağında yan tarafına anestezi edilmiş bir Zebra balığı yerleştirmek için künt forseps kullanın ve yüzgecizin %50'sini rezeksiyonetmek için neşter kullanın. Daha sonra uygun deneysel ajan ile desteklenen balık suyu 300 mililitre içeren bir otoklav kabı içine balık yerleştirin ve Zebrafish kaçış önlemek için folyo ile beher kapağı. Bir yüzgeci kırığı yaralanmasına neden olmak için, bir kesme mikroskobu altında 100 milimetre agarose kaplı Petri çanak kendi lateral tarafında bir anestezi Zebrabalığı yerleştirin ve bir çatlak görünene kadar bir iğne hafifçe kemikli bir yüzgeç ışın segmentine bir enjeksiyon iğnesi itin.
Bu büyük ölçüde stabilite bozabilir, çünkü yüzgeç içine çok fazla kırık tanıtmak önemlidir. Daha sonra uygun deneysel ajan ile birlikte balık suyu 300 mililitre içeren bir otoklav içine balık aktarın. Kalvarial kafatası yaralanması oluşturmak için, kalvarial kemikler kolayca bir diseksiyon mikroskobu altında görselleştirilir böylece dik pozisyonda bir anestezi Zebrabalığı tutun.
Frontal kemiğin ortasına 500 mikrometrematkap ucuyla donatılmış dönen bir mikro matkap yerleştirin ve mikro matkap çapak büyüklüğünde bir delik açmak için kemiğe hafifçe dokunun. Yaralanmayı üretirken matkabı yanal hareket ettirmemek ve dokunun direnci düştükten hemen sonra durmak çok önemlidir. Aksi takdirde, beyin zarar göreceksiniz.
Sonra uygun deneysel ajan ile birlikte balık suyu 300 mililitre içeren bir otoklav içine balık yerleştirin. Uygun bir geçici kap içine Zebrafish ve balık suyu aktararak ve taze ilaç takviye balık suyu ile beher doldurarak günlük beher su değiştirin. Sonra onun beher için Zebrafish dönmek için bir balık ağı kullanın.
Toplamda iki güne kadar süren tedaviler için Zebrabalığı beslemeyin. Daha uzun deneyler sırasında, zebra balıklarını her iki günde bir 0,5 ila bir mililitre yumurtadan çıkan Artemia SSP ile besleyin. Yüzgeç yaralanması analizi için, ince hasat ve kütüğün bir kenarında yüzgeç kavramak için ince forseps kullanın.
Karşı kütük kenarını kapmak için ikinci bir çift forseps kullanın ve 10 ila 20 saniye boyunca soğuk%4 PFA içeren yemeğin dibine hafifçe doku basın. Gerektiğinde yüzgeç düzlemetekrarlayın. Yüzgeç şimdi kıvrılma olmadan düz yatıyordu gerekir.
Fiksasyon dan sonra uzun süreli numune depolama için, üç 20 dakikalık PBS yıkar ve artan bir metanol serisi ile doku yıkayın. Örnekler daha sonra eksi 20 santigrat derecede %100 metanolde saklanabilir. Alizarin Kırmızı boyama için, rehydrate metanol inen bir metanol serisi pbs iki 20 dakika yıkar ve deiyonize suda bir beş dakika yıkama takip örnekleri depolanır.
Son yıkamadan sonra, alizarin kırmızı solüsyonu örnek dokuya ekleyin ve uygun boyama süresi için sallanan oda sıcaklığında örnek inkübe. Örnekleri temizlemek için, azalan% 1 potasyum hidroksit gliserol serisi ile doku tedavi. Sonra% 80 gliserol çözeltisi için bir-bir% 0.1 potasyum hidroksit örnekleri saklayın ve hayal için% 80 gliserol ile dokuları monte.
Calcein boyama için, alüminyum folyo ile kaplı bir cam kabında 20 dakika calcein çözeltisi 100 milimetre aynı anda üç Zebrabalığı kadar kuluçka. Kuluçka sonunda, balık suyu bir kap için Zebrafish aktarın ve balık su yeni bir kap onları aktarmadan önce kısa bir süre yüzmek izin. Yüzgeç rereres canlı görüntüleri elde etmek için ikinci kabın 20 dakika sonra, bir agarose kaplı Petri çanak üzerine bir anestezi Zebrabalığı yerleştirin ve stereo mikroskopile yüzgeci görüntü.
Yenileyici kafatası kemiklerinin görüntülerini elde etmek için Zebrafish'i süngerin içinde dik olarak yerleştirin ve floresan mikroskopi ile kafatasını görüntüleyin. Prednizolon ile tedavi, diğer glukokortikoidler benzer, sabit kaudal fin dokusunun Alizarin Kırmızı boyama tarafından tespit kemik oluşumu da dahil olmak üzere fin rejenerasyon genel bir inhibisyonu yol açar. Benzer şekilde, ilaç kalvariyal kafatası yaralanması kapatma üzerinde geciktirici etkisi vardır.
İmmünsupresyon nedeniyle, azaltılmış makrofaj numaraları da anti-mCherry ve anti-GFP antikor boyama ve transgenik MPEG-1 mCherry Prednisolone tedavi hayvanlardan Zebrafish kafatası doku örnekleri üzerinde Osterix NGFP Zebrafish ile geçti kullanılarak kanıtlanan dondurulmuş doku bölümlerinde immünohistokimya ile tespit edilebilir. Bu prosedürleri denerken, yaralanma denemelerini son derece tekrarlanabilir bir şekilde gerçekleştirerek kemik rejenerasyon hızındaki değişkenliği en aza indirmek önemlidir. Mikrobiyal enfeksiyonu önlemek için otoklavlı balık suyu içeren otoklavlı gagalarda tek ev Zebrabalığı için de çok önemlidir.
Bu protokol glukokortikoid eylem altta yatan mekanizmaları ele yardımcı olacaktır. Örneğin, glukokortikoid indüklenen osteoporoz bağlamında ve aynı zamanda diğer ilaçlar ve diğer Zebrabalığı kemik kullanımı için adapte edilebilir.
