我们的协议描述了基于基因回路的诊断的设计、组装和验证。这些基于纸张的分子诊断方法成本低且灵敏，能够检测临床相关浓度的核酸，并且可以设计用于检测几乎任何序列。这是一种平台技术，可以由用户根据他们的需求设计，并有可能将临床级诊断带入更分散的牙科资源设置。
无细胞脚趾开关传感器几乎可以设计用于任何基于核酸的靶标。最近的工作已经证明了埃博拉、诺如病毒、SARS-CoV-2、艰难梭菌和致伤寒细菌的无细胞诊断。演示该程序的将是博士后研究员Severino Jefferson Rivero da Silva和我实验室的博士生Pouriya Bayat。
要设计脚趾开关，请从寨卡病毒基因组中识别靶序列，并从扩增子中选择寨卡病毒靶序列，如文本协议中所述。下载脚趾开关设计软件包。打开 MATLAB 并导航到设计软件文件夹。
将目标序列输入到位于输入子文件夹中的设计输入文件 csv 文件中。选择要用于设计功能的参数。运行设计功能，为感兴趣的目标生成脚趾开关设计。
完成后，导航到final_designs文件夹，并在 csv 格式的电子表格中找到顶部脚趾开关设计序列和相应的目标序列。确保算法生成的脚趾开关 DNA 序列在五个素数端包含 T7 启动子序列，在三个素数端包含保守的 21 个核苷酸接头序列。使用 NCBI BLAST 通过检查序列同源性来筛选针对其他常见病毒的顶部脚趾开关设计序列。
接受血化低于 40% 的序列。在无核酸酶水中制备浓度为10微摩尔的脚趾开关发夹DNA寡核苷酸和反向扩增引物的溶液。根据此表在冰上的PCR管中组装反应。
按照本表中列出的循环条件将反应管放入热循环仪中。分析琼脂糖凝胶上的PCR产物。纯化PCR产物并在最小体积的无核酸酶水中洗脱DNA，以确保足够高的浓度。
使用分光光度计定量DNA。通过将25毫克粉末溶解在一毫升无核酸酶的水中来制备CPRG储备溶液。根据此处所示的标准方案在冰上制备预混液。
将无细胞预混液分配到PCR管中。对于无细胞对照和单独开关对照，加入无核酸酶水至5.94微升体积。对于反应，加入PCR纯化的脚趾开关DNA，得到终浓度为33纳摩尔。
为了测试脚趾开关和靶RNA组合，将体外转录的靶RNA添加到终浓度为1微摩尔。通过移液和短暂离心彻底混合所有反应。在黑色透明底384孔板上，向反应孔周围的孔中加入30微升无核酸酶水。
然后使用两毫米活检冲头和镊子，切下BSA堵塞的滤纸盘并将它们放入反应孔中。从每个反应管中分配1.8微升到384孔板中的滤纸盘上，一式三份。用透明的PCR膜覆盖板并将其放入酶标器中。
每分钟在570摄氏度下测量37纳米处的吸光度，持续130分钟。在无核酸酶水中制备所有正向和反向引物组的 25 μmol 储备溶液。使用此处所示的预混液设置五微升反应。
通过移液混合，直到白色沉淀溶解，然后分配到PCR管中。将正向和反向引物添加到适当的试管中，然后加入一微升无核酸酶水或两皮摩尔靶触发RNA。通过轻轻移液混合并短暂旋转试管。
在热循环仪上设置孵育方案，如下所示。12分钟后，取出试管并向每个试管中加入1.25微升酶混合物，然后混合和离心。跳过41摄氏度保持步骤后，将试管放回热循环仪，开始一小时的反应孵育。
然后，为了评估引物性能，组装基于纸张的无细胞脚趾开关反应并分析数据。对于灵敏度分析，鉴定候选引物对，并在无核酸酶水中制备靶RNA的连续稀释液。用生物一式三份中的选定引物组重复NASBA和无细胞反应。
使用一微升提取的患者RNA，进行NASBA扩增和基于纸张的无细胞反应，如第五节所示。反应后，准备384孔反应板，并在便携式酶标仪中以37摄氏度运行测定。然后组装RT-qPCR组分，并根据该表将试剂添加到1.5毫升微量离心管中。
通过移液混合反应。将 6.5 微升分配到 96 孔或 384 孔 PCR 板的每个孔中，然后每个 RNA 模板 3.5 微升一式三份。将PCR膜放在板的顶部。
将 384 孔板以 600 倍 G 离心两分钟。将板放入RT-qPCR仪中并运行循环条件，如下所示。按照计算设计，构建了三个脚趾开关，并使用琼脂糖凝胶电泳进行分析。
大约3，000个碱基对的条带表明反应成功。根据各自的体外转录触发RNA评估脚趾开关。虽然所有三个传感器都显示出吸光度的增加，但传感器27B的导通速率最快，而开关33B和47B的开/关比较低，表明背景活性和特异性降低。
570 nm处吸光度的倍数变化表明，开关27B在开/关信号比下具有最佳性能。此外，当与NASBA结合使用时，它可以检测浓度低至每微升124个分子的RNA，表明灵敏度高。对来自巴西的寨卡病毒患者样本进行了测试，以使用便携式酶标仪评估传感器的临床诊断准确性。
颜色从黄色变为紫色，鉴定出阳性样品。通过PLUM便携式酶标仪上的集成软件绘制每个纸质反应的比色响应随时间的变化。超过阈值的样本被认为是阳性的。
通过与RT-qPCR进行比较，确定了传感器的临床性能。当循环阈值等于或小于38时，样品被认为是阳性的。在进行患者试验之前，重要的是要确保脚趾开关屏幕和NASBA引物灵敏度的结果是可重复和优化的。
鉴于其简单性和适应性，这里描述的诊断平台为开发新的护理点工具铺平了道路，这些工具可以为卫生系统带来好处，特别是对低收入国家。
