我们的同质PROTACs是Cereblon的第一个化学抑制剂，可能有助于进一步阐明沙利度胺类比的分子机制，以及研究Cereblon的生理功能。这种新的 PROTAC 平台技术对于专门针对那些被认为无法追踪的感兴趣的蛋白质非常有用。CRBN抑制本身没有抗肿瘤活性。
然而，CRBN降解器可能对肥胖、传染病和其他疾病有临床影响。合成具有挑战性，在设计 PROTAC 化合物时，很难找到最佳的链接剂和附件来生成有效的蛋白质降解剂。首先，将 2.46 克受 Boc 保护的 L-谷氨酰胺和 50 毫升四氢素放在 100 毫升圆底烧瓶中，并在 800 rpm 转速下搅拌一分钟。
然后，加入1.95克1，1'碳二米达佐和催化量4-丙胺。在回流下继续搅拌 10 小时，以获得谷氨酸化合物的透明无色溶液。让溶液冷却至室温，用旋转蒸发器去除溶剂。
在200毫升乙酸乙酯中重新溶解残留物，然后倒入分离漏斗中。用50毫升的去离子水和盐水清洗有机层，将有机层干燥硫酸钠。重力过滤溶液通过硅胶去除干燥剂，然后用200毫升乙酸乙酯冲洗硅胶。
在真空下从滤物中去除溶剂，获得无色固体化合物1。在使用前在真空下干燥产品过夜。接下来，在装有搅拌棒的100毫升圆底烧瓶中溶解0.50克醋酸钠，在20毫升的冰川醋酸中溶解。
加入1.25克3氟磷酸氢和1.14克谷氨酸，在回流搅拌6小时，获得化合物3的紫色溶液。让混合物冷却至室温，然后倒入100毫升的去维化水中，搅拌10分钟，沉淀化合物3。通过过滤收集固体，用水和石油醚清洗，并在真空中干燥两天。
接下来，将0.83克化合物三和20毫升干二甲基硫化物放在50毫升的施伦克烧瓶中，搅拌两分钟。加入0.22克α欧米茄二胺链接剂化合物6和1.05毫升N，N-二异丙基胺，并在90摄氏度的砷下搅拌混合物18小时，在深绿色的混合物中获得同源8。让混合物冷却至室温，倒入100毫升去压水中。
将产品提取成乙酸乙酯的三个50毫升部分，将有机层混合，用50毫升水和盐水清洗。将洗净的有机层干燥硫酸钠，过滤掉干燥剂，在真空下去除溶剂。在少量色谱溶剂中重新溶解残留物，并应用于硅胶柱进行纯化。
收集荧光产品馏分，将它们混合，并去除溶剂，以获得 Homodimer 8 作为黄色固体。首先，在100毫升的圆底烧瓶中溶解2.28克谷氨酰胺1在25毫升二甲基甲酰胺中。在此溶液中悬浮 2.76 克碾磨碳酸钾。
然后，将0.62毫升的碘胺放入装有20针的注射器中。在 10 秒内添加碘烷滴。用橡胶隔膜塞开烧瓶，并加入通风针。
在室温下对混合物进行两个小时的声波化，以获得谷氨酸化合物2。用50毫升乙酸乙酯稀释混合物，倒入分离漏斗中。再用50毫升乙酸乙酯将烧瓶冲洗到漏斗中。
处理产品，用硅胶柱色谱进行净化，获得谷氨酸2作为无色固体。比较谷氨酸化合物1和2的保留时间，确认N-甲基化成功。要开始验证，用感兴趣的化合物治疗多发性骨髓瘤细胞。
分离相关蛋白质，并准备样品进行蛋白质降解的西式 Blot 分析。然后，为SDS-PAGE准备一个凝胶三明治，然后用pH 8.9三轮车-HCl溶液填充阳极缓冲罐。将蛋白质样品加载到凝胶中，以 70 伏特运行 20 分钟，然后运行 115 伏特 150 分钟。
接下来，准备1x转移缓冲液进行免疫印迹，并小心地将凝胶从盒式转移到转移缓冲液以平衡。当您从盒式磁带上取出凝胶以进行平衡时，必须非常小心，因为它会很快爆裂和皱褶。将0.45微米聚乙烯二氟化物膜浸入纯甲醇中至少20秒，以激活它，然后浸入1倍转移缓冲液中。
让凝胶和膜平衡10分钟。然后，组装西印盒，并应用180毫安百分90分钟，将蛋白质转移到膜上。之后，通过免疫污染来可视化蛋白质。
为了评估对细胞生存能力的影响，首先，在生物三酯的96孔板中，每孔播种5万个多发性骨髓瘤细胞。将含有DMSO的介质添加到每井100微升，或化合物8、化合物9或波马利多米德的0.1、1或10微摩尔。为了进行细胞生存能力救援实验，在加入一个微摩尔解poalidomide之前或之后，用化合物8的100纳米摩尔溶液治疗细胞3小时。
在5%的二氧化碳大气中，在37摄氏度下孵育细胞24、48或96小时，并用发光测定测量细胞的生存能力。用质子和碳 NMR 确认了同源 PROTAC 8 的结构。异质PROTAC 9被合成为负对，因为谷氨酸部分内的N甲基化导致Cereblon或CRBN的结合能力丧失。
同性 PROTAC 8 诱导近乎完全的原体 CRBN 降解，对淋巴转录因子 IKZF1 和 IKZF3 的影响最小。相比之下，异质PROTAC 9表现出与波马利多米德相似的行为。化合物8诱导的CRBN降解可以通过蛋白酶体的直接抑制剂阻止，或间接阻止纯酶抑制。
使用化合物8进行预处理的细胞显著抵制了多巴利多米德对IKZF1和IKZF3的影响。化合物8诱导CRBN降解对多发性骨髓瘤细胞在96小时后生存能力的影响比化合物9和poalidomide的IKZF1和IKZF3降解小得多。与未经治疗的细胞相比，使用化合物8进行预处理的多发性骨髓瘤细胞在接触波巴利多米德时具有显著更高的生存能力，这表明化合物8可用于模拟免疫调节 IMiD 耐药性。
我们发现，化合物8诱导Cereblon完全蛋白酶体降解，对IKZF1和IKZF3细胞的生存能力和增殖无副作用。将项目技术扩展到其他目标有可能对与癌症和其他疾病有关的蛋白质进行检测和跟踪。当将这种技术应用于其他药物和蛋白质时，应仔细研究药物的分子结构和蛋白质靶点，以选择最佳的连链接剂和附件。
IMiDs在小鼠中不起作用，因为Cereblon的点突变，但存在一个转基因敲击小鼠模型，可用于进一步的动物研究。由于波马利多胺是一种模拟沙利度胺，这是高度致畸性，我们不建议孕妇使用这些药物。
