多夏巴氏杆菌自主表达采用除抑制技术

这种方法可以帮助Pichia Pastoris菌株预先选择染色体克隆，在增加扩展之前，通过简单的摇瓶培养，在减压条件下表达重组蛋白。该技术的主要优点是，可以使用Pichia Pastoris实现高水平的甲醇自由蛋白表达，该表达由对重要栽培参数的精确在线监测支持。一般来说，新方法的个体可能难以为之奋斗，因为开始玻璃生长饲料的时间点必须适应特定生产菌株的生长特性。

在建立主要培养之前，在50ml锥形管中将兴趣表达菌株的单一新鲜菌群播种到5毫升酵母辣椒和葡萄糖汤中。将盖子稍微打开，以便正确开瓶。比，将培养力在 28 摄氏度、80% 湿度和 100 到 130 RPM 的摇床中过夜。

第二天早上，开始通过蓝牙连接设备的软件。接下来，按下生物质测量设备正面的银色按钮，打开与设备的蓝牙连接，然后单击计算机监控软件中的查找设备。将找到的设备拖到测量纸盒中的方块，然后单击"连接"。

成功连接后，将显示一个控制屏幕。要设置实验，请单击"开始测量"。命名实验并检查监视所需的所有参数是否已启用。

将间隔设置为三分钟，将平均测量点设置为 11。输入样本的名称并跳过角度校准。测量在600纳米波长的分光光度计培养介质中以一到二十比稀释的过夜培养的细胞密度。

接种50毫升的培养与过夜培养到OD 600的05。比，将烧瓶放在探测器中，温度为 28 摄氏度、130 RPM 和 80% 湿度，持续 5 分钟。单击软件中的"开始测量"。

接种后四小时，使用2ml样本进行细胞密度测量，正如刚刚证明的。当氧气浓度接近零且细胞处于指数生长阶段时，在无菌条件下向每个烧瓶添加四个甘油进料盘。比，将烧瓶返回摇培养箱，再多花 60 到 90 个小时。

每24小时采集一次样品，通过选择测定来监测细胞密度和蛋白质表达。在栽培结束时，将培养物转移到50毫升锥形管中进行离心。从软件中导出在线测量数据作为电子表格文件进行进一步分析。

在这个代表性的栽培中，起始甘油浓度为5%虽然当生物量呈指数级增长时加入进料盘，但氧气含量降至接近零。降低甘油浓度可降低短期氧气限制的影响，因此建议用于抑制蛋白质表达。在这个具有代表性的实验中，人类生长激素在碳源抑制促进剂的控制之下表达，甘油耗尽时，通过去压抑来抑制蛋白质表达，通过每个烧瓶添加四个饲料盘来保证蛋白质表达。

正如预期的那样，在甘油饲料盘存在的情况下，人类生长激素表达和生物量发育会随着时间的推移而增加，而蛋白质表达会随着时间的流逝而减少，在没有甘油补充剂的情况下，生物量保持不变。在尝试此过程时，必须记住仔细观察培养参数以确定最佳表达式开始时间。按照这个程序，其他方法，如蛋白质浓度测定西方印迹分析或活性测定，可以进行蛋白质产量评估，以及小规模生物反应器实验，以回答有关单个菌株在更大尺度上的性能的其他问题。

该技术开发后，为甲醇自由重组蛋白表达领域的研究人员探索了一种有希望的替代方案，以替代Pichia牧师上常用的甲醇依赖的 AOX1 促进剂。