Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da pesquisa translacional, como a relação entre biomarcadores circulantes e o prognóstico do paciente. A principal vantagem dessa técnica é a chance de avaliar a expressão de um painel de biomarcadores circulantes com uma metodologia fácil e confiável com baixa quantidade de material de entrada. As implicações dessa técnica se estendem à terapia de pacientes com câncer, pois poderia identificar biomarcadores circulantes úteis na tomada de decisão e monitoramento do tratamento dos pacientes.
Além disso, este método pode fornecer insights sobre a análise de biomarcadores circulantes. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como análise de expressão biomarcadora de tecido para caracterização molecular da doença. A demonstração visual deste método é fundamental, pois os passos de extração são difíceis de aprender.
Para começar, transfira 400 microliters da amostra de plasma para um tubo de dois mililitros sem RNase. Em seguida, adicione 400 microliters de solução de desnaturação ao tubo. Adicione quatro microliters de um nanomolar.
Depois de misturar a solução, adicione 800 microliters de fenol-clorofórmio ácido. Vórtice a solução por 60 segundos, e centrífuga em velocidade máxima por 15 minutos. Em seguida, transfira o lisato contido na fase aquosa superior para um tubo limpo, tomando cuidado para não perturbar a interfase.
Meça o volume da fase aquosa recuperada e adicione 1/3 de volume de etanol ao lisato. Em seguida, coloque um cartucho de filtro em um tubo de coleta fresco. Transfira até 700 microliters da mistura etanol-lysate para o cartucho do filtro.
Centrifugar o cartucho do filtro por 30 segundos a 10.000 vezes a gravidade. Em seguida, meça o volume total do fluxo. Em seguida, adicione 2/3 do volume de etanol ao filtrado e misture bem.
Coloque um segundo cartucho de filtro em um tubo de coleta fresco. Em seguida, transfira até 700 microliters da amostra para o cartucho, e centrífuga a 10.000 vezes a gravidade por 30 segundos antes de descartar o fluxo-through. Adicione 700 microliters de solução de lavagem de microRNA ao cartucho do filtro e centrifuá-lo com um tubo de coleta a 10.000 vezes a gravidade por 15 segundos.
Descarte o fluxo-through e coloque o cartucho do filtro de volta no mesmo tubo. Depois disso, mova o cartucho do filtro para um novo tubo de coleta. Em seguida, adicione 100 microliters de solução de eluição pré-aquecido ao cartucho.
Centrifugar o cartucho do filtro a 10.000 vezes de gravidade durante 30 segundos para recuperar as microRNAs. Prepare o coquetel de mistura de reação de poliadenilação de acordo com o protocolo de texto. Transfira dois microliters da amostra para cada poço de uma placa de reação.
Em seguida, adicione três microliters do coquetel de reação a cada poço. Vórtice e centrífuga a placa brevemente para girar o conteúdo. Em seguida, coloque a placa em um cicloviário térmico e siga o procedimento descrito no protocolo de texto.
Prepare o coquetel de mistura de reação de ligadura em um tubo de centrífuga. Em seguida, adicione 10 microliters do coquetel a cada poço da placa de reação. Em seguida, misture o conteúdo da placa de reação em um shaker a 1.900 rpm por um minuto, seguido de uma breve centrífuga da placa.
Depois disso, coloque a placa de reação em um cicloviário térmico e siga o procedimento descrito no protocolo de texto. Para realizar a reação de transcrição reversa, prepare a mistura de reação em um tubo de centrífuga de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, adicione 15 microliters da mistura a cada poço da placa contendo produto de ligadura.
Misture o conteúdo da placa em um shaker a 1.900 rpm por um minuto, seguido de uma breve centrífuga da placa. Em seguida, coloque a placa em um cicloviário térmico e siga o procedimento descrito no protocolo de texto. Em seguida, prepare a mistura de reação miR-Amp e adicione 45 microliters da mistura a cada poço de uma nova placa de reação.
Depois disso, adicione cinco microliters do produto RT a cada poço da placa de reação. Misture a placa em um shaker a 1.900 rpm por um minuto, seguido por uma breve centrífuga da placa. Em seguida, coloque a placa em um cicloviário térmico e siga o procedimento descrito na tabela um do protocolo de texto.
Primeiro, diluir cada amostra de cDNA no buffer TE. Em seguida, prepare a mistura de reação pcr em um tubo de centrífuga. adicionando 10% do volume em excesso.
Transfira 19 microliters da mistura de reação para cada poço da placa. Sele a placa e centrífuga brevemente. Por fim, execute o protocolo térmico em um sistema RT-PCR, conforme descrito na tabela dois do protocolo de texto.
Diluições seriais de controle de pico foram realizadas para escolher qual foi a melhor concentração para adicionar em todas as amostras de plasma desta série de casos particulares. Graças a este protocolo, foi possível avaliar todos os biomarcadores em cada paciente, bem como um único biomarcador na série geral de casos. Neste protocolo, um painel de miRNAs circulantes relacionadas à angiogênese em relação à sobrevida livre de progressão, sobrevida geral e taxa de resposta objetiva foi analisado em pacientes com câncer colorretal tratados com regime quimioterápico.
Comparando-se os níveis de expressão do miRNA entre a linha de base e a primeira avaliação clínica, observou-se um aumento no has-miR-155-5p. Esse aumento foi associado a PFS e OS mais curtos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de realizar os passos usando fenol-clorofórmio sob um capô de fumaça. Após esse procedimento, outros métodos como isolamento e análise de proteínas circulantes ou RNAs de codificação podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais, como a avaliação de um painel mais exaustivo de biomarcadores circulantes.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da biópsia líquida explorarem a expressão de biomarcadores circulantes em pacientes com câncer. Não se esqueça que trabalhar com reagentes de sangue e químicos pode ser extremamente perigoso, e precauções como luvas e casaco de laboratório devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
