Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области трансляционных исследований, такие как взаимосвязь между циркулирующими биомаркерами и прогнозом пациента. Основным преимуществом этого метода является возможность оценить экспрессию панели циркулирующих биомаркеров с простой и надежной методологией с низким количеством входного материала. Последствия этого метода распространяются на терапию онкологических больных, поскольку он может определить циркулирующие биомаркеры, полезные для принятия решений и мониторинга лечения пациентов.
Кроме того, этот метод может дать представление о циркулирующих биомаркеров анализа. Он также может быть применен к другим системам, таким как анализ экспрессии биомаркеров тканей для молекулярной характеристики заболевания. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как шаги извлечения трудно узнать.
Для начала перенесите 400 микролитров образца плазмы в трубочку без RNase с двумя миллилитровами. Затем добавьте в трубку 400 микролитров денатурированного раствора. Добавьте четыре микролитров однономоляного шипа.
После смешивания раствора добавьте 800 микролитров кислотного фенола-хлороформа. Вихрь раствор в течение 60 секунд, и центрифуга на максимальной скорости в течение 15 минут. Затем перенесите лизат, содержащийся в верхней фазе, в чистую трубку, заботясь о том, чтобы не нарушить межфаз.
Измерьте объем извлеченной фазы и добавьте 1/3 объема этанола в лизат. Затем поместите фильтр картридж в новую трубку сбора. Перенесите до 700 микролитров этанол-лизатной смеси в картридж фильтра.
Центрифуга фильтра картриджа в течение 30 секунд при 10000 раз тяжести. Далее, измерить общий объем потока через. Затем добавьте 2/3 объема этанола в фильтрат и хорошо перемешайте.
Поместите второй картридж фильтра в новую трубку коллекции. Затем перенесите до 700 микролитров образца на картридж и центрифугу при 10 000 раз больше гравитации в течение 30 секунд, прежде чем сбросить протеку. Добавьте 700 микролитров раствора для мытья микроРНК в картридж фильтра и центрифугайте его коллекторной трубкой при 10 000 раз больше гравитации в течение 15 секунд.
Отбросьте протечку и поместите картридж фильтра обратно в ту же трубку. После этого переместив картридж фильтра в новую коллекционую трубку. Затем добавьте к картриджу 100 микролитров разогретого раствора элюции.
Центрифуга фильтр картриджа в 10000 раз тяжести в течение 30 секунд, чтобы восстановить микроРНК. Подготовь полиаденилирование реакционной смеси коктейля в соответствии с текстовым протоколом. Перенесите два микролитера образца на каждую колодец реакционной пластины.
Затем добавьте три микролитров реакционной коктейля к каждому хорошо. Vortex и центрифуга пластины кратко спина вниз содержимое. Затем поместите пластину в тепловой циклер и следуйте процедуре, изложенной в текстовом протоколе.
Подготовка перевязки реакции смесь коктейль в центрифуге трубки. Затем добавьте 10 микролитров коктейля к каждому колодец реакционной пластины. Затем смешайте содержимое реакционной пластины на шейкере при 1 900 об/мин в течение одной минуты, а затем краткую центрифугу пластины.
После этого поместите реакционной пластины в тепловой циклер, и следуйте процедуре, изложенной в текстовом протоколе. Для выполнения реакции обратной транскрипции подготовьйте смесь реакции в центрифуге в соответствии с текстовым протоколом. Затем добавьте 15 микролитров смеси к каждому колодец пластины, содержащей перевязоченный продукт.
Смешайте содержимое пластины на шейкере при 1 900 об/мин в течение одной минуты, а затем краткую центрифугу пластины. Затем поместите пластину в тепловой циклер и следуйте процедуре, изложенной в текстовом протоколе. Затем приготовьте смесь реакции miR-Amp и добавьте 45 микролитров смеси к каждому колодец новой реакционной пластины.
После этого добавьте пять микролитров продукта RT к каждому колодец реакционной пластины. Смешайте тарелку на шейкере при 1 900 об/мин в течение одной минуты, а затем краткую центрифугу пластины. Затем поместите пластину в тепловой циклер и следуйте процедуре, изложенной в таблице одного из текстовых протоколов.
Во-первых, разбавить каждый образец cDNA в буфере TE. Затем подготовьте смесь реакции ПЦР в центрифуге трубки. добавляя 10% от объема сверх.
Перенесите 19 микролитров реакционной смеси на каждый колодец пластины. Печать пластины, и центрифуга его кратко. Наконец, выполните тепловой протокол по системе RT-PCR, как указано в таблице 2 текстового протокола.
Серийное разбавление контроля шипов было выполнено для того, чтобы выбрать, какая из них является наилучшей концентрацией для добавления во все образцы плазмы этой конкретной серии случаев. Благодаря этому протоколу, можно было оценить все биомаркеры в каждом пациенте, а также один биомаркер в общей серии случаев. В этом протоколе, группа ангиогенеза связанных циркулирующих миРНК в связи с прогрессией свободной выживаемости, общее выживание, и объективный уровень ответа был проанализирован у пациентов с колоректальным раком лечение с химиотерапией режима.
Сравнивая уровни экспрессии миРНК между базовой и первой клинической оценкой, наблюдалось увеличение уровня миР-155-5p. Это увеличение было связано с более короткими PFS и OS. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы выполнить шаги с использованием фенол-хлороформа под капотом дыма. После этой процедуры, другие методы, такие как изоляция и анализ циркулирующих белков или кодирования РНК могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как оценка более исчерпывающей панели циркулирующих биомаркеров.
После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области жидкой биопсии, чтобы исследовать выражение циркулирующих биомаркеров у больных раком. Не забывайте, что работа с кровью и химическими реагентами может быть чрезвычайно опасным, и меры предосторожности, такие как перчатки и лабораторное пальто всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
