שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המחקר התרגומי, כגון הקשר בין סמנים ביולוגיים במחזור לבין הפרוגנוזה של המטופל. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ההזדמנות להעריך את הביטוי של פאנל של סמנים ביולוגיים במחזור עם מתודולוגיה קלה ואמינה עם כמות נמוכה של חומר קלט. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב כלפי טיפול של חולי סרטן כי זה יכול לזהות סמנים ביולוגיים במחזור שימושי בקבלת החלטות וניטור טיפול של חולים.
כמו כן, שיטה זו יכולה לספק תובנה על ניתוח סמנים ביולוגיים במחזור. זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות, כגון ניתוח ביטוי סמן ביולוגי רקמות עבור אפיון מולקולרי של מחלה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כמו שלבי החילוץ קשה ללמוד.
כדי להתחיל, להעביר 400 microliters של דגימת הפלזמה לתוך RNase חינם, שני מיליליטר צינור. לאחר מכן, להוסיף 400 microliters של פתרון denaturing לצינור. הוסף ארבעה מיקרוליטרים של ספייק-אין ננו-מולאר אחד.
לאחר ערבוב הפתרון, מוסיפים 800 מיקרוליטרים של חומצה פנול-כלורופורם. Vortex הפתרון במשך 60 שניות, צנטריפוגה במהירות מקסימלית במשך 15 דקות. לאחר מכן, להעביר את lysate הכלול בשלב המים העליון לצינור נקי, דואג לא להפריע interphase.
למדוד את נפח השלב הממיקי התאושש, ולהוסיף 1/3 נפח של אתנול לליזט. לאחר מכן, מניחים מחסנית מסנן לתוך צינור איסוף טרי. מעבירים עד 700 מיקרוליטרים של תערובת האתנול-ליסאט למחסנית המסנן.
צנטריפוגה מחסנית המסנן במשך 30 שניות ב 10, 000 פעמים כבידה. לאחר מכן, למדוד את הנפח הכולל של זרימה דרך. לאחר מכן, מוסיפים 2/3 מנפח האתנול לסינון, ומערבבים היטב.
מניחים מחסנית סינון שנייה בצינור איסוף טרי. לאחר מכן, להעביר עד 700 microliters של המדגם למחסנית, וצנטריפוגה ב 10, 000 פעמים כבידה במשך 30 שניות לפני השלכת הזרימה דרך. הוסף 700 מיקרוליטרים של פתרון שטיפת microRNA למחסנית המסנן, וצנטריפוג אותו עם צינור איסוף ב 10, 000 פעמים כבידה במשך 15 שניות.
השלך את הזרימה דרך, והחזר את מחסנית המסנן לאותו צינור. לאחר מכן, העבר את מחסנית המסנן לצינור איסוף חדש. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטרים של פתרון אלוט שחומם מראש למחסנית.
צנטריפוגה מחסנית המסנן ב 10, 000 פעמים כבידה במשך 30 שניות כדי לשחזר את microRNAs. מכינים את תערובת תגובת הפוליאדנילציה לפי פרוטוקול הטקסט. מעבירים שני מיקרוליטרים של הדגימה לכל באר של צלחת תגובה.
לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיקרוליטרים של קוקטייל התגובה לכל באר. מערבולת וצנטריפוגה הצלחת בקצרה כדי לסובב את התוכן. לאחר מכן, מקם את הלוח במחזור תרמי ובצע את ההליך המתואר בפרוטוקול הטקסט.
מכינים את תערובת תגובת הקשירה בצינור צנטריפוגה. לאחר מכן, מוסיפים 10 microliters של הקוקטייל לכל באר של צלחת התגובה. לאחר מכן, מערבבים את התוכן של צלחת התגובה על שייקר ב 1, 900 סל"ד במשך דקה אחת, ואחריו צנטריפוגה קצרה של הצלחת.
לאחר מכן, מקם את לוח התגובה במחזור תרמי ובצע את ההליך המתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לבצע את תגובת שעתוק הפוכה, להכין את תערובת התגובה בצינור צנטריפוגה על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, מוסיפים 15 מיקרוליטרים של התערובת לכל באר של הצלחת המכילה מוצר קשירה.
מערבבים את תכולת הצלחת על שייקר ב 1, 900 סל"ד במשך דקה אחת, ואחריו צנטריפוגה קצרה של הצלחת. לאחר מכן, מקם את הלוח במחזור תרמי ובצע את ההליך המתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הכינו את תערובת התגובות miR-Amp, והוסיפו 45 מיקרוליטרים של התערובת לכל באר של צלחת תגובה חדשה.
לאחר מכן, להוסיף חמישה microliters של המוצר RT לכל באר של צלחת התגובה. מערבבים את הצלחת על שייקר ב 1, 900 סל"ד במשך דקה אחת, ואחריו צנטריפוגה קצרה של הצלחת. לאחר מכן, מקם את הלוח במחזור תרמי ובצע את ההליך המתואר בטבלה אחד מפרוטוקול הטקסט.
תחילה, לדלל כל דוגמת cDNA במאגר TE. לאחר מכן, להכין את התגובה PCR לערבב צינור צנטריפוגה. הוספת 10% מאמצעי האחסון עודף.
מעבירים 19 מיקרוליטרים של תערובת התגובה לכל באר של הצלחת. לאטום את הצלחת, צנטריפוגה זה לזמן קצר. לבסוף, בצע את הפרוטוקול התרמי במערכת RT-PCR, כמתואר בטבלה 2 של פרוטוקול הטקסט.
דילול סדרתי של שליטה ספייק-in בוצעו על מנת לבחור איזה היה הריכוז הטוב ביותר להוסיף את כל דגימות הפלזמה של סדרת מקרה מסוימת זו. הודות לפרוטוקול זה, ניתן היה להעריך את כל סמנים ביולוגיים בכל חולה, כמו גם סמן ביולוגי יחיד בסדרת המקרים הכוללת. בפרוטוקול זה, פאנל של miRNAs במחזור הקשורים אנגיוגנזה ביחס הישרדות ללא התקדמות, ההישרדות הכוללת, שיעור התגובה האובייקטיבית נותחה בחולים עם סרטן המעי הגס שטופלו במשטר כימותרפיה.
השוואת רמות הביטוי של miRNA בין הערכה קלינית בסיסית הראשונה, עלייה יש-miR-155-5p נצפתה. עלייה זו הייתה משויכת ל- PFS ו- OS קצרים יותר. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבצע את השלבים באמצעות פנול-כלורופורם מתחת למכסה המנוע אדים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בידוד וניתוח של חלבונים במחזור או RNAs קידוד על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו הערכה של פאנל ממצה יותר של סמנים ביולוגיים במחזור.
לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביופסיה הנוזלית לחקור את הביטוי של סמנים ביולוגיים במחזור חולי סרטן. אל תשכח כי עבודה עם דם וריג'ים כימיים יכול להיות מסוכן מאוד, אמצעי זהירות כגון כפפות מעיל מעבדה תמיד צריך לקחת בעת ביצוע הליך זה.
