Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación traslacional, como la relación entre los biomarcadores circulantes y el pronóstico del paciente. La principal ventaja de esta técnica es la posibilidad de evaluar la expresión de un panel de biomarcadores circulantes con una metodología fácil y fiable con baja cantidad de material de entrada. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de pacientes con cáncer porque podría identificar biomarcadores circulantes útiles en la toma de decisiones y el seguimiento del tratamiento de los pacientes.
Además, este método puede proporcionar información sobre el análisis de biomarcadores circulantes. También se puede aplicar a otros sistemas, como el análisis de expresión de biomarcadores de tejidos para la caracterización molecular de la enfermedad. La demostración visual de este método es crítica, ya que los pasos de extracción son difíciles de aprender.
Para empezar, transfiera 400 microlitros de la muestra de plasma a un tubo de dos mililitros sin RNase. A continuación, agregue 400 microlitros de solución de desnaturalizadora al tubo. Agregue cuatro microlitros de un pinchatro nanomolar.
Después de mezclar la solución, añadir 800 microlitros de fenol-cloroformo ácido. Vórtice la solución durante 60 segundos, y centrifugar a máxima velocidad durante 15 minutos. A continuación, transfiera el izado contenido en la fase acuosa superior a un tubo limpio, teniendo cuidado de no perturbar la interfase.
Mida el volumen de la fase acuosa recuperada y añada 1/3 de volumen de etanol al izado. A continuación, coloque un cartucho de filtro en un tubo de recogida nuevo. Transfiera hasta 700 microlitros de la mezcla de etanol-izado al cartucho de filtro.
Centrifugar el cartucho del filtro durante 30 segundos a 10.000 veces la gravedad. A continuación, mida el volumen total del flujo a través. A continuación, agregue 2/3 del volumen de etanol al filtrado y mezcle bien.
Coloque un segundo cartucho de filtro en un tubo de recogida fresco. A continuación, transfiera hasta 700 microlitros de la muestra al cartucho y centrifugar a 10.000 veces la gravedad durante 30 segundos antes de descartar el flujo a través. Agregue 700 microlitros de solución de lavado de microRNA al cartucho del filtro y centrífelo con un tubo de recogida a 10.000 veces la gravedad durante 15 segundos.
Deseche el paso de flujo y vuelva a colocar el cartucho del filtro en el mismo tubo. Después de esto, mueva el cartucho del filtro a un nuevo tubo de recogida. A continuación, añada 100 microlitros de solución de elución precalentada al cartucho.
Centrifugar el cartucho del filtro a 10.000 veces la gravedad durante 30 segundos para recuperar los microRNAs. Preparar el cóctel de mezcla de reacción de poliadenilación de acuerdo con el protocolo de texto. Transfiera dos microlitros de la muestra a cada pozo de una placa de reacción.
A continuación, agregue tres microlitros del cóctel de reacción a cada pozo. Vórtice y centrifugar la placa brevemente para girar hacia abajo el contenido. A continuación, coloque la placa en un ciclor térmico y siga el procedimiento descrito en el protocolo de texto.
Prepare el cóctel de mezcla de reacción de ligadura en un tubo centrífugo. A continuación, añada 10 microlitros del cóctel a cada pozo de la placa de reacción. A continuación, mezcle el contenido de la placa de reacción en una coctelera a 1.900 rpm durante un minuto, seguido de una breve centrífuga de la placa.
Después de esto, coloque la placa de reacción en un ciclor térmico y siga el procedimiento descrito en el protocolo de texto. Para realizar la reacción de transcripción inversa, prepare la mezcla de reacción en un tubo de centrífuga de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, añada 15 microlitros de la mezcla a cada pocód en el pozo de la placa que contiene el producto de ligadura.
Mezclar el contenido de la placa en una coctelera a 1.900 rpm durante un minuto, seguido de una breve centrífuga de la placa. A continuación, coloque la placa en un ciclor térmico y siga el procedimiento descrito en el protocolo de texto. A continuación, prepare la mezcla de reacción miR-Amp y agregue 45 microlitros de la mezcla a cada pozo de una nueva placa de reacción.
Después de esto, añadir cinco microlitros del producto RT a cada pozo de la placa de reacción. Mezclar la placa en una coctelera a 1.900 rpm durante un minuto, seguida de una breve centrífuga de la placa. A continuación, coloque la placa en un ciclor térmico y siga el procedimiento descrito en la tabla uno del protocolo de texto.
Primero, diluya cada muestra de ADNc en el búfer TE. A continuación, prepare la mezcla de reacción PCR en un tubo centrífugo. añadiendo el 10% del volumen en exceso.
Transfiera 19 microlitros de la mezcla de reacción a cada pozo de la placa. Selle la placa y centrifuga brevemente. Finalmente, realice el protocolo térmico en un sistema RT-PCR, como se describe en la tabla dos del protocolo de texto.
Se realizaron diluciones en serie de control de picos para elegir cuál era la mejor concentración para añadir en todas las muestras plasmáticas de esta serie de casos en particular. Gracias a este protocolo, fue posible evaluar todos los biomarcadores en cada paciente, así como un solo biomarcador en la serie de casos generales. En este protocolo, se analizó un panel de miRNAs circulantes relacionados con la angiogénesis en relación con la supervivencia libre de progresión, la supervivencia global y la tasa de respuesta objetiva en pacientes con cáncer colorrectal tratados con un régimen de quimioterapia.
Comparando los niveles de expresión de miRNA entre la línea de base y la primera evaluación clínica, se observó un aumento en has-miR-155-5p. Este aumento se asoció con SLP y sistema operativo más cortos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar los pasos usando fenol-cloroformo bajo una campana de humo. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el aislamiento y el análisis de proteínas circulantes o la codificación de ARN para responder a preguntas adicionales, como la evaluación de un panel más exhaustivo de biomarcadores circulantes.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biopsia líquida exploraran la expresión de biomarcadores circulantes en pacientes con cáncer. No olvide que trabajar con sangre y reactivos químicos puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como guantes y bata de laboratorio durante la realización de este procedimiento.
