この方法は、循環バイオマーカーと患者の予後との関係など、翻訳研究分野における重要な質問に答える助けとなります。この技術の主な利点は、少量の入力材料で簡単かつ信頼性の高い方法論で循環バイオマーカーのパネルの発現を評価する機会です。この技術の意味は、患者の意思決定と治療の監視に有用な循環バイオマーカーを同定することができるため、がん患者の治療に及ぶ。
また、この方法は、循環バイオマーカー分析に関する洞察を提供することができる。また、疾患の分子特性解析のための組織バイオマーカー発現解析などの他のシステムにも適用できる。抽出手順は学習が困難であるため、この方法の視覚的なデモンストレーションは重要です。
まず、400マイクロリットルのプラズマサンプルをRNaseフリーの2ミリリットルチューブに移します。次いで、400マイクロリットルの変性溶液をチューブに加えます。1ナノモルスパイクインの4マイクロリットルを追加します。
溶液を混合した後、800マイクロリットルの酸フェノール-クロロホルムを加える。60秒間溶液をボルテックスし、15分間最高速度で遠心分離機を使用します。次に、上層水相に含まれるライセートをクリーンチューブに移し、相間を乱さないような注意を払う。
回収した水相の体積を測定し、1/3量のエタノールをライセートに加えます。次に、フィルターカートリッジを新しい回収管に入れ。最大700マイクロリットルのエタノール-ライセート混合物をフィルターカートリッジに移します。
フィルターカートリッジを重力の10,000倍で30秒間遠心分離します。次に、フロースルーの総量を測定します。その後、濾液にエタノールの容積の2/3を加え、よく混ぜます。
2つ目のフィルターカートリッジを新しい回収管に入れる。次に、最大700マイクロリットルのサンプルをカートリッジに移し、遠心分離機を10,000倍の重力で30秒間送り、フロースルーを廃棄します。フィルターカートリッジに700マイクロRNA洗浄液を加え、10,000倍の重力で15秒間、回収管で遠心分離します。
フロースルーを破棄し、フィルターカートリッジを同じチューブに戻します。その後、フィルタカートリッジを新しい回収管に移動します。次に、100マイクロリットルの予熱溶出液をカートリッジに加えます。
マイクロRNAを回収するために30秒間、フィルターカートリッジを10,000倍の重力で遠心します。テキストプロトコルに従ってポリアデニル化反応ミックスカクテルを準備します。サンプルの2マイクロリットルを反応板の各ウェルに移します。
次に、反応カクテルを3マイクロリットルずつ各ウェルに加えます。渦と遠心分離機は、内容物を回転させるためにプレートを短時間回転させます。次に、プレートをサーマルサイクラーに入れ、テキストプロトコルで概説されている手順に従います。
遠心分離管にライゲーション反応ミックスカクテルを準備します。次に、反応板の各ウェルに10マイクロリットルのカクテルを加えます。次に、1,900rpmのシェーカーに反応板の内容物を1分間混ぜ、続いてプレートの短い遠心分離機を混ぜます。
この後、反応プレートをサーマルサイクラーに入れ、テキストプロトコルで概説した手順に従います。逆転写反応を行うために、テキストプロトコルに従って遠心分離管で反応ミックスを調製する。次に、ライゲーション生成物を含むプレートの各ウェルに15マイクロリットルの混合を加える。
1,900 rpmのシェーカーにプレートの内容物を1分間混ぜ、続いてプレートの短い遠心分離機を混ぜます。次に、プレートをサーマルサイクラーに入れ、テキストプロトコルで概説されている手順に従います。次に、miR-Amp反応ミックスを調製し、新しい反応プレートの各ウェルに45マイクロリットルのミックスを加えます。
この後、反応板の各ウェルにRT生成物の5マイクロリットルを加えます。1,900 rpmのシェーカーにプレートを1分間混ぜ、その後にプレートの短い遠心分離機を混ぜます。次に、プレートをサーマルサイクラーに入れ、テキストプロトコルの表1に示す手順に従います。
まず、TEバッファ内の各cDNAサンプルを希釈します。次いで、PCR反応ミックスを遠心チューブに調製します。ボリュームの10%を超過して追加します。
19マイクロリットルの反応ミックスをプレートの各ウェルに移します。プレートを密封し、遠心分離機を短くします。最後に、RT-PCR システムで熱プロトコルを実行します(テキスト プロトコルの表 2 に示します)。
スパイクイン制御の連続希釈は、この特定のケースシリーズのすべての血漿サンプルに加える最良の濃度を選択するために行った。このプロトコルのおかげで、すべての患者のすべてのバイオマーカーと、ケースシリーズ全体の単一のバイオマーカーを評価することが可能でした。本議定書では、無増悪生存、全生存、および客観的応答率に関連した血管新生関連循環miRNAのパネルを、化学療法レジメンで治療した大腸癌患者において分析した。
ベースラインと最初の臨床評価との間のmiRNAの発現レベルを比較すると、has-miR-155-5pの増加が認められた。この増加は、短い PFS と OS に関連していました。この手順を試みる間、ヒュームフードの下でフェノールクロロホルムを使用して手順を実行することを忘れないでください。この手順に従うと、循環タンパク質の単離および分析やRNAのコーディングなどの他の方法は、循環バイオマーカーのより徹底的なパネルの評価のような追加の質問に答えるために行うことができます。
その開発後、この技術は、液体生検の分野の研究者が癌患者の循環バイオマーカーの発現を探求する道を開いた。血液や化学試薬を使用すると非常に危険であり、手袋や実験室コートなどの予防措置は、常にこの手順を実行しながら取られる必要があることを忘れないでください。
