Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im bereichder translationaler Forschung zu beantworten, wie z. B. die Beziehung zwischen zirkulierenden Biomarkern und der Patientenprognose. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, die Expression eines Panels von zirkulierenden Biomarkern mit einer einfachen und zuverlässigen Methodik mit geringer Menge an Eingangsmaterial zu bewerten. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Krebspatienten, da sie zirkulierende Biomarker identifizieren könnte, die für die Entscheidungsfindung und Behandlungsüberwachung von Patienten nützlich sind.
Diese Methode kann auch Einblicke in die Analyse von zirkulierenden Biomarkern geben. Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, wie Gewebe Biomarker Expressionsanalyse für die molekulare Charakterisierung von Krankheiten. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Extraktionsschritte schwer zu erlernen sind.
Übertragen Sie zunächst 400 Mikroliter der Plasmaprobe in eine RNase-freie, zweiMilliliter-Röhre. Dann 400 Mikroliter Denaturierungslösung in das Rohr geben. Fügen Sie vier Mikroliter ein-Nanomolar-Spike-in hinzu.
Nach dem Mischen der Lösung 800 Mikroliter Säurephenol-Chlorform hinzufügen. Wirbel die Lösung für 60 Sekunden, und Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit für 15 Minuten. Als nächstes übertragen Sie das in der oberen wässrigen Phase enthaltene Lysat in ein sauberes Rohr, wobei darauf zu achten ist, dass die Interphase nicht gestört wird.
Messen Sie das Volumen der wiedergewonnenen wässrigen Phase und fügen Sie dem Lysat ein 1/3 Volumen Ethanol hinzu. Legen Sie dann eine Filterpatrone in ein frisches Sammelrohr. Bis zu 700 Mikroliter des Ethanollysatgemisches auf die Filterpatrone übertragen.
Zentrifugieren Sie die Filterpatrone 30 Sekunden lang bei 10.000-facher Schwerkraft. Als Nächstes messen Sie das Gesamtvolumen des Durchflusses. Dann 2/3 des Ethanolvolumens in das Filtrat geben und gut mischen.
Legen Sie eine zweite Filterpatrone in ein frisches Sammelrohr. Übertragen Sie dann bis zu 700 Mikroliter der Probe auf die Patrone und zentrifugieren Sie 30 Sekunden lang mit der 10.000-fachen Schwerkraft, bevor Sie den Durchfluss entsorgen. Fügen Sie der Filterpatrone 700 Mikroliter microRNA-Waschlösung hinzu und zentrifugieren Sie sie mit einem Sammelrohr mit 10.000-facher Schwerkraft für 15 Sekunden.
Entsorgen Sie den Durchfluss, und legen Sie die Filterpatrone wieder in das gleiche Rohr. Danach verschieben Sie die Filterpatrone in ein neues Sammelrohr. Fügen Sie dann 100 Mikroliter vorgeheizte Elutionslösung in die Patrone ein.
Zentrifugieren Sie die Filterpatrone mit der 10.000-fachen Schwerkraft 30 Sekunden lang, um die microRNAs wiederherzustellen. Bereiten Sie den Polyadenylierungs-Reaktionsmix-Cocktail gemäß dem Textprotokoll vor. Zwei Mikroliter der Probe auf jeden Brunnen einer Reaktionsplatte übertragen.
Dann fügen Sie drei Mikroliter des Reaktionscocktails zu jedem Brunnen hinzu. Wirbel und Zentrifugieren Sie die Platte kurz, um den Inhalt zu drehen. Legen Sie als Nächstes die Platte in einen thermischen Cycler, und folgen Sie dem im Textprotokoll beschriebenen Verfahren.
Bereiten Sie den Ligationsreaktionsmix-Cocktail in einem Zentrifugenrohr vor. Als nächstes fügen Sie 10 Mikroliter des Cocktails zu jedem Brunnen der Reaktionsplatte hinzu. Dann mischen Sie den Inhalt der Reaktionsplatte auf einem Shaker bei 1, 900 U/min für eine Minute, gefolgt von einer kurzen Zentrifuge der Platte.
Legen Sie danach die Reaktionsplatte in einen thermischen Cycler und folgen Sie dem im Textprotokoll beschriebenen Verfahren. Um die umgekehrte Transkriptionsreaktion durchzuführen, bereiten Sie den Reaktionsmix in einem Zentrifugenrohr gemäß dem Textprotokoll vor. Dann fügen Sie 15 Mikroliter der Mischung zu jedem Brunnen der Platte enthalten Ligation Produkt.
Mischen Sie den Inhalt der Platte auf einem Shaker bei 1, 900 U/min für eine Minute, gefolgt von einer kurzen Zentrifuge der Platte. Legen Sie als Nächstes die Platte in einen thermischen Cycler, und folgen Sie dem im Textprotokoll beschriebenen Verfahren. Dann bereiten Sie den miR-Amp-Reaktionsmix vor und fügen Sie 45 Mikroliter der Mischung zu jedem Brunnen einer neuen Reaktionsplatte hinzu.
Danach fünf Mikroliter des RT-Produkts in jeden Brunnen der Reaktionsplatte geben. Mischen Sie die Platte auf einem Shaker bei 1, 900 U/min für eine Minute, gefolgt von einer kurzen Zentrifuge der Platte. Legen Sie dann die Platte in einen thermischen Cycler, und folgen Sie dem in Tabelle 1 des Textprotokolls beschriebenen Verfahren.
Verdünnen Sie zunächst jede cDNA-Probe im TE-Puffer. Bereiten Sie dann den PCR-Reaktionsmix in einem Zentrifugenrohr vor. 10 % des Volumens im Übermaß.
Übertragen Sie 19 Mikroliter der Reaktionsmischung auf jeden Brunnen der Platte. Versiegeln Sie die Platte, und zentrieren Sie sie kurz. Führen Sie schließlich das thermische Protokoll auf einem RT-PCR-System aus, wie in Tabelle 2 des Textprotokolls beschrieben.
Serielle Verdünnungen der Spike-in-Kontrolle wurden durchgeführt, um zu wählen, welche die beste Konzentration war, die in allen Plasmaproben dieser speziellen Fallserie hinzugefügt werden sollte. Dank dieses Protokolls konnten alle Biomarker bei jedem einzelnen Patienten sowie ein einzelner Biomarker in der gesamten Fallreihe ausgewertet werden. In diesem Protokoll wurde ein Panel von angiogenesebedingten zirkulierenden miRNAs in Bezug auf progressionsfreies Überleben, Gesamtüberleben und objektive Ansprechrate bei Patienten mit Dickdarmkrebs analysiert, die mit einer Chemotherapie behandelt wurden.
Vergleicht man die Expressionsniveaus von miRNA zwischen der Baseline und der ersten klinischen Bewertung, wurde ein Anstieg von has-miR-155-5p beobachtet. Dieser Anstieg war mit kürzeren PFS und OS verbunden. Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, daran zu denken, die Schritte mit Phenol-Chlor-Form unter einer Dunstabzugshaube durchzuführen. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Isolierung und Analyse zirkulierender Proteine oder kodierende RNAs durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie die Auswertung eines umfassenderen Panels zirkulierender Biomarker.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der flüssigen Biopsie, um die Expression von zirkulierenden Biomarkern bei Krebspatienten zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Blut und chemischen Reagenzien extrem gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie Handschuhe und Labormantel sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.
