该协议描述了一种将微血管内皮细胞与骨骼肌分离的平台技术。例如，这些细胞可用于进一步深入了解血液肌肉屏障功能。与现有方法相比，该技术的主要优点是能够分离出纯度高的原发性微血管内皮细胞。
这项技术可以帮助回答免疫促进肌肉疾病领域的关键问题，如肌肉和内皮细胞在健康和疾病中的相互作用。首先，准备协议中描述的所有所需的解决方案和六孔板。要开始实际程序，请获得一双手术锋利的/钝剪刀、一把手术锋利的/锋利的剪刀以及笔直和弯曲的钳子。
用70%乙醇消毒所有手术器械。将安乐死成年雄性小鼠放在其背部，用70%乙醇滋润腿部。使用锋利的/钝器手术剪刀，通过切割臀部关节切断每条整个腿。
将四肢放在封闭的细胞培养盘中。将菜转移到无菌层流罩上。使用锋利的剪刀和弯曲的钳子将皮肤从臀部切开到脚趾尖。
使用直钳握住脚趾或脚垫，同时使用弯曲钳子将皮肤从脚趾剥到臀部。要分离肌肉四头肌，切下膝盖的肌腱，将股骨的肌肉切断至臀部。切断跟腱，以隔离三头肌。
接下来，沿着头骨切到罂粟花，并去除肌肉。要去除无法分离的肌腱，请用弯曲的钳子握住肌肉，并切断每个合适的肌腱。将2，445微升的准备好的消化液加入新鲜、有标签的细胞培养皿中，并确定重量。
将所有肌肉碎片转移到这道菜上。然后，确定重量。两个测量值的差值提供肌肉组织的干重，不能超过一克。
使用手术锋利的剪刀，将整个肌肉组织切成小块。在37摄氏度下用5%二氧化碳孵育组织悬浮液1.5小时，确保每20分钟将悬浮液与一毫升胰岛素注射器小心地混合约5分钟。孵育后，将悬浮液转移到放置在50毫升标签管上的70微米尼龙过滤器上，然后收集流经。
用8毫升DMEM清洗细胞过滤器，并收集流经。如果碎片堵塞了过滤器，则重新暂停分离溶液。丢弃细胞过滤器，在重力 300 倍和 20 摄氏度下将悬浮液离心机 10 分钟。
小心地去除上流剂，将细胞颗粒重新在一毫升氯化铵钾解液中，用于红血球的解液。在室温下孵育30秒。然后，加入含有10%FCS的9毫升DMEM，以停止反应。
将电池悬浮液转移到15毫升管。然后，使用 Neubauer 细胞计数室来确定细胞数。为了开始消耗CD45阳性细胞，在重力300倍和4摄氏度下将悬浮液离心10分钟。
完全去除上流液，将细胞颗粒重新在90微升的MCS缓冲液中。加入 10 微升 CD45 微珠并混合悬浮液。在4至8摄氏度的冰箱中孵育15分钟。
在此之后，添加一毫升的 MCS 缓冲液。在重力300倍和4摄氏度下离心10分钟。完全去除上流液，将细胞重新填充在500微升的MCS缓冲液中。
在分离器的磁场中放置一个大磁柱。用三毫升的 MCS 缓冲液冲洗柱的储液罐。然后，在柱子下方放置一个 15 毫升的圆锥管，以收集流通过。
将整个单元格悬浮液应用于列，并让它完全流过。将三毫升 MCS 缓冲液添加到每个洗涤步骤的储液罐中，然后等待柱的储液罐是空的，然后开始下一个洗涤步骤，从而将柱式缓冲液洗涤三次。收集通过列的未标记单元格，以执行进一步的分离步骤。
要开始积累CD31阳性细胞，请使用纽鲍尔细胞计数室来确定细胞数。之后，在重力的300倍和摄氏4度的下将未标记的细胞离心10分钟。完全去除上流液，将颗粒重新在 90 微升 MCS 缓冲液中。
添加 10 微升 CD31 微珠，混合整个悬浮液。在4至8摄氏度的冰箱中孵育15分钟。在此之后，加入一毫升的MCS缓冲液，并在300倍的重力下和4摄氏度下离心10分钟。
取出上流液，在500微升MCS缓冲液中重新填充细胞。将中磁柱定位在分离器的磁场中。用 500 微升 MCS 缓冲液冲洗柱。
接下来，在柱子下方放置一个 15 毫升的圆锥形管，以收集流通过。将整个单元悬浮液应用到列上，让它完全流过。在每个洗涤步骤的储液罐中加入 500 微升 MCS 缓冲液，将柱中三次清洗，然后等待柱的储液罐为空，然后开始下一个洗涤步骤。
通过列的未标记单元格表示 CD45 负数、CD31 负分数。将它们存储以进行进一步的质量控制。然后，从分离器上取出柱子，并将其放在合适的收集管上。
将两毫升 MCS 缓冲液移到柱子上。立即将柱塞推入柱中，以冲洗磁性标记的电池。此 CD45 负数，CD31 阳性分数表示富集的主要 murine 2。
在重力 350 倍和 20 摄氏度下将电池悬浮液离心 5 分钟。完全去除上一提液，将细胞重新在一毫升内皮细胞培养中。将细胞转移到一个涂层的六井培养板的单一井，该井含有一毫升内皮细胞培养基。
在培养过程中，在37摄氏度下用5%的二氧化碳在无菌培养箱中孵育细胞，确保每两三天刷新一次培养基。当细胞在80%至90%的汇合时，用两毫升PBS在两个连续的洗涤步骤中冲洗每个包含的细胞两次。然后，在每井中加入800微升的三辛EDTA溶液，并在37摄氏度下用5%的二氧化碳在无菌培养箱中孵育3至5分钟。
在此之后，添加 1，200 微升的 DMEM，包含至少 10%FCS，以停止酶活性。在重力350倍和20摄氏度下离心5分钟。然后，如前所述，累积 CD31 细胞以提高纯度。
使用具有 20% 放大倍率和 0.35 镜头数值光圈的明亮场或标准相收缩显微镜来观察细胞汇合。在这项研究中，原发性穆林骨骼肌微血管内皮细胞被分离。隔离一天后，原发性MMECs和残余的其他细胞形成联合体，并坚持培养皿的底部。
从第七天开始，可以观察到扁平和拉长的细胞，但是，其他，主要是球状细胞的污染仍然可见。因此，需要通过 MCS 进行另一个 CD31 阳性选择周期。此后，原发性杂音MMEC在汇合时扩散到大约80至90%的密度，它们通常形成纵向对齐细胞的非重叠单层。
由于接触抑制，增殖在汇合时停止。通过流式细胞学进行质量控制，显示分离后立即对细胞的生存能力和纯度值，每个值约为 70%。通过 MCS 进行另一个 CD31 阳性选择后培养的细胞显示纯度和生存能力的满意值，每个值高达 95%。
然后通过定量PCR对获得细胞进行肌肉卫星细胞标记基因配对盒蛋白7和M-cadherin的基因表达。正如预期的那样，只有CD45阴性、CD31阴性分数以及分化的原发性穆林肌肉细胞表示盒蛋白7和M-cadherin，而CD45阴性、CD31阳性和原发性杂物对于这些标记物是负数。在第二个CD31 MCS步骤之后，qPCR用于评估汇合原麦地干中紧密结蛋白的表达。
初级穆林 MMECs 被看到表达高水平的克劳丁-5，奥克鲁丁，和分区遮挡-1，而pmMC只显示一个低表达的区黄素-1。此技术可以在五到六个小时内执行。按照此协议，可以执行其他方法，如迁移分析或低剪切应力实验，以回答其他问题。
看完这段视频后，您应该能够通过机械和酶分离和磁细胞分选，将原发性微血管内皮细胞从骨骼肌中分离。
