单分子荧光能量转移研究核糖体蛋白质合成

单分子FRET可以捕获纳米距离内发生的动力学，这是核糖体蛋白生物合成过程的正确尺度。核糖体通过协调多种因素和组件来发挥作用，这在本质上是不健康的。单分子方法可以跟踪每个核糖体，而不受这种不温不图的平均效应的限制。

这种方法将揭示抗生素如何抑制核糖体功能，以开发新的药物对耐药细菌感染。首先，通过将启动的 EFTU、NOG 和 PAG 混合在 37 摄氏度下以 1 比 2 比 2 的比例混合两分钟来准备 PRE。孵化后，用1.1摩尔蔗糖垫超浓缩在10万次G.准备后，混合启动EFTU，WG和PHE混合在37摄氏度的1比2到2的比例10分钟。

孵化后，用1.1摩尔蔗糖垫超浓缩隔夜以10万倍G.清洁显微镜玻璃滑梯，其中包含6对直径为1毫米的孔和1.5号显微镜玻璃盖唇。在300摄氏度下烘烤干净的滑梯和盖片三个小时，然后用氨基沙林覆盖覆盖。在干净的层压罩中，将一个盖片平放在表面上。

小心地将 60 微升 PEG 溶液放在顶部边缘，然后在顶部放置另一个盖片，让毛细电效应将溶液分散到它们之间，确保不会形成气泡。重复这些步骤，再重复两对盖片。将这些盖片存放在装满水的空尖端盒中，并在黑暗中孵育三个小时。

三小时后，将盖片分开，连续用水冲洗三根熔炉，用干氮流清洗。将锋利的移液器尖穿过玻璃滑梯上的孔，直到它们紧密地安装。刮掉锋利的末端，直到它们与玻璃表面完全平整，然后用通道图案切割双面胶带。

将玻璃滑梯粘在平侧的玻璃滑梯上。将涂层的盖唇粘在双面胶带上，然后按压，使样品室密封紧密，确保涂层侧朝内。打开计算机和显微镜开关。

启动激光控制界面并打开激光。按下激光控制盒上的启用按钮，为激光预热。打开摄像机，然后启动显微镜相关软件程序。

单击上部快门并单击灯。将 10 微升 5%Tween-20 添加到 1 毫升 TAM10 缓冲器中，为 Tween 缓冲器准备 TAM10。在一个小微中心管中称重三毫克葡萄糖氧化酶，并加入45微升的卡塔拉酶，准备脱氧溶液。

旋涡管轻轻溶解固体。在微中心以 20，000 倍 G 旋转一分钟，并服用超高纳特。根据文本手稿中的说明，准备 30%葡萄糖溶液、200 毫摩尔特罗洛克斯溶液和每毫升 0.5 毫克链球菌素溶液。

在草皮目标中加入一滴成像油。将样品室放在目标上。在房间中装满10微升链球菌素溶液，等待一分钟。

用 30 微升 TAM10 用 Tween 缓冲器清洗房间，用折叠的滤纸收集直通溶液。洗完后等一分钟。用 Tween 缓冲器将核糖体复合物 PRE 或 POST 稀释到 10-15 纳米摩尔浓度与 TAM10。

将核糖体样品的20微升加载到通道中，等待两分钟。使用 TAM10 缓冲器的 50 微升和脱氧葡萄糖和特罗洛克斯溶液的 0.5 微升进行成像缓冲。混合好。

用 30 毫升的成像缓冲器冲洗腔室。设置相机以获取图像。单击上百叶窗并关闭灯。

启动相机采集，将图像传播到三个窗口，代表两个单独的摄像机和覆盖物。在获取菜单下，选择捕获时间拉时，然后自动单击捕获。设置适当的文件名称、文件路径和循环数，然后单击当前运行。

图像采集完成后关闭弹出窗口，然后打开已收购的 ND 文件。单击投资回报率，简单的ROI编辑器，并选择选项圈。选择图像上的 ROI，并在完成后单击完成。

单击测量、时间测量以显示数据作为图或电子表格。打开出口标签设置出口参数，然后单击出口以节省强度。最后，打开已使用适当应用程序导出的文件。

从 L27 标记残留物到 A 站点或 P 站点 tRNA 的距离分别为 61 或 52 安斯特伦，对应的 FRET 效率为 0.47 和 0.65。捐赠者和接受者渠道的荧光强度被检索和绘制为时间延误。供体漂白后，两个痕迹都接近基线，因为接受者不能直接产生兴奋。

接受者漂白后，供体强度增加，因为较少的反应通路消散了激发能量。由于 tRNA 的摆动运动，单个核糖体表现出不同的波动，这导致了 L27 的距离波动。其他方法，如普洛霉素检测，检测，脚趾印测定和质量规格是免费的单分子FRET方法，并揭示有关蛋白质合成的更多细节。

单分子FRET具有广泛的应用，因为许多生物过程发生在纳米范围内，在毫秒的时间尺度。通过在适当的位置标记适当的染料，可以揭示许多其他动态。