我们的协议帮助研究人员实施标准化的实验管道，通过免疫荧光染色对类似人群进行表型表征。通过这项技术，研究人员可以严格分析复杂疾病组织的类似组成，对感兴趣的细胞类型的表型进行定性和定量分析。演示这个程序的将是西德尼·马汉，一个来自我实验室的技术人员。
为使动物为胸腺动脉的收获做好准备，将腹膜切到胸骨，注意不要损害腹部组织。并在中轴线通过胸部进行两次切口，注意不要损害心脏和肺部。然后，切开隔膜，部分暴露心脏。
要大量使用小鼠，请安装重力灌注系统，使富液的压力相当于平均尿毒血，以便保持血管形态的一致流动和维护。然后，用5毫升的室温PBS，10毫升的4%室温半成甲醛，以及5毫升的室温PBS。将 23 或 25 量蝶针连接到重力灌注系统，然后通过针头运行 PBS 以将空气从管子中排出，然后再将针头插入左心室。
将针头固定到位后，使用虹膜剪刀在右中庭中做不到两厘米的切口。将感兴趣的组织收获成新鲜4%的甲状甲醛。要暴露胸腔动脉，请使用剪刀将胸骨的中线切口通过胸腔，并使用钳子拉肋骨的两侧以完全打开胸腔。
接下来，将动物置于解剖显微镜下，以部分可视化胡萝卜素，并使用细钳子拉肌肉、结缔组织和脂肪，直到右侧胡萝卜素、胸腔动脉、亚胸腔分叉和主动脉拱门清洁和分离周围的结缔组织和脂肪。接下来，使用钳子抓住其分叉下方的右侧卡罗蒂，并在钳子上方进行初始切割。尽管如此，还是拿着胡萝卜，通过亚冠动脉进行第二次切口，最后两次切入胸腔动脉两侧的主动脉拱门。
然后，收集任何其他感兴趣的血管组织，并在室温下将脑脑动脉和其他组织放在4%的甲醛溶液中过夜。对于脑动脉的免疫荧光染色，使用微原子通过石蜡嵌入组织样本获得10微米分段，直到光显微镜可以确认主动脉已切过，胸腔动脉可见。调整块的方向，直到组织完全垂直于微切刀片，并获得三个连续10微米厚的胸腔动脉每个玻璃幻灯片部分，直到达到亚截面分叉。
收集所有部分后，将组织样品水合在化学罩下，进行两次五分钟二甲苯浸入，然后进行五分钟浸入乙醇系列，以及两次五分钟脱水浸水。接下来，根据标准方案，在抗原检索解决方案中孵育幻灯片，随后在微波炉中加热20分钟。在室温下冷却一小时后，使用疏水笔包围每个组织部分。
并在室温下用阻塞缓冲液阻止任何非特异性结合一小时。在孵化结束时，在四摄氏度下将组织样本与感兴趣的原抗体鸡尾酒或等型匹配IgG控制抗体标记过夜。第二天早上，在PBS中洗三次，每次洗涤5分钟，随后在适当的荧光结合二次抗体鸡尾酒和DAPI中孵育一小时，用于细胞核可视化。
然后，使用适合荧光显微镜的安装介质将盖玻片安装到幻灯片上。对于标记组织部分的共声显微镜成像，请使用沾有 IgG 控制和初级抗体的部分来设置探测器的灵敏度、激光功率和每个通道的偏移量。然后，设置 z 堆栈采集的上部和下部位置，并确定要成像的堆栈的厚度和数量。
获取所有图像后，打开 ImageJ 中的图像并打开通道工具面板，并伪颜色不同的染色通道。合并颜色通道。所有通道应在同一图像上可见。
在通道工具面板中打开和关闭各个颜色通道，右键单击计数图标以选择多点工具。双击计数图标以打开点工具面板，然后选择用于计算单元格的项目的类型和大小。检查全部显示并仅在通道工具面板中打开 DAPI 通道。
然后，选择计数器通道零并单击要标记的单个核，滚动通过 z 堆栈来计算感兴趣区域内染色的所有核。点工具面板中显示的量化单单元格事件数如下。当所有核都标记后，打开另一个染色通道并选择计数器通道一个，以标记 DAPI 和抗体染色之间有结肠化的细胞。
对于细胞质染色，选择细胞核周围的整个细胞核，并检查多个z堆栈，必要时。然后，结果可以表示为单元格数到 DAPI 阳性细胞的总数，或感兴趣区域内每个区域的单元格数。如所证明，使用针对表型标记的抗体进行免疫荧光染色，可以获取每个标记染色和差分干扰对比的图像，从而划定单细胞计数感兴趣的区域。
然后，可以使用 ImageJ 执行单细胞计数，以确定不同平滑肌肉细胞源群的丰度。例如，这些代表性横截面的纤维帽区的单细胞计数分析显示，使用抗IL-1 β抗体治疗的小鼠和接受同型匹配IgG控制的小鼠之间的纤维帽区域细胞组成存在显著差异。事实上，IL-1β的抑制与YFP阳性平滑肌细胞的减少和高蛋白-3阳性细胞的增加有关。
此外，观察到YFP阳性平滑肌肉大体阿尔法作用-正平滑肌肉细胞的数量减少。而平滑肌细胞衍生的YFP阳性高细胞-3阳性巨噬细胞的相对数量显著增加，在两个胸腔动脉位置。值得注意的是，IL-1β的抑制没有影响病变内骨质疏松细胞的总数，也没有影响平滑肌细胞衍生细胞或巨噬细胞衍生的软骨细胞的比例。
该协议旨在通过标准化组织收集、处理和分段等关键步骤以及单细胞计数，提高动脉硬化病变分析的严格性和可重复性。该协议可用于分析其他血管床，容易呈现动脉硬化病变，包括大动脉和大动脉根。
