使用脑和脊柱联合手术用双病毒载体靶向新生大鼠的皮质脊髓束

这是第一个证明新生大鼠皮质脊髓束成功合并感染的方案。它为研究年轻哺乳动物细胞的单个亚群如何促进脊髓损伤的恢复提供了准确的蓝图。与其他双病毒载体技术一样，这种方法允许用户准确地转导神经元的特定亚群，从而使研究人员能够确定各种化学遗传学技术在促进恢复方面的有效性。

我们希望不熟悉这种技术的研究人员难以找到正确的脊柱解剖结构。因此，我们鼓励您经常不断计算椎段，并始终参考您的地标。在确认新生儿Sprague Dawley幼犬的麻醉深度后，通过按压头皮顶部中线的镊子来确定切口的区域，感受矢状缝合线。

保持皮肤绷紧以确保干净、笔直和精确的切口，沿着矢状缝合平面从 I 线上方开始做一个 1 厘米的切口。接下来，通过沿着颅骨表面轻轻探查镊子来识别前膛，密切注意缝合线和由沿顶骨和额骨运行的镊子引起的凹痕。通过在感兴趣的一侧应用加重钩子来保持开口。

使用棉尖和微型剪刀的组合清除腱膜，以最大限度地提高前膛的暴露，从而提高准确性。确保冠状缝合线在足够远的横向视野中，以便为后续注射提供粗略的模板。使用微型剪刀，切出紧邻前膛骨的左额颅骨的大约三乘两毫米的部分。

用棉尖清除任何碎屑、脑脊液和血液。要注射病毒，请将针头放置到位并对注射器进行编程，以每分钟 250 纳升的速度注射一微升。注射完成后，让针头在皮质中停留三分钟。

在其他坐标处重复注射，沿皮层相对于前膛总共注射三次，深度均为0.6毫米。完成注射后，缝合头皮并将动物转移到另一张手术台进行颈椎板切除术。用手指触诊颅底以识别切口部位。

用拇指和食指拉紧皮肤。使用11号刀片，在颅底后方1至2毫米的中线开始切口，并将切口向后延伸一厘米以露出浅表肌肉。使用刀片的尖头，沿着浅表肌的中线轻轻地进行一系列切割，以暴露脊髓腔和深部脊柱肌肉。

然后用一对镊子张开肌肉并观察手术窗口。一旦深部脊柱肌肉暴露出来，将牵开器插入手术窗口，并将手术窗口缩回至7至8毫米宽，从而可以一览无余地看到脊柱。通过其突出的棘突来识别第二颈椎，该棘突向背侧突出并包裹着一个大的圆顶形肌肉。

使用刮骨器的平坦边缘，轻轻刮掉两侧的深部脊柱肌肉，使 C3 到 C7 椎骨暴露。从内侧开始，沿平行于椎板的方向横向刮擦，以确保适当的暴露，从而清楚地区分椎板。用棉尖控制出血。

在计算椎体水平时，以C2为指导，使用一把微型剪刀小心地在C6和C7处切割软骨层的侧边缘。使用一对细镊子，小心地取出薄片的解剖部分以露出脊髓，确保脊柱窗口足够大以容纳所需的注射部位。将动物放在立体定位颅骨支架中，并在动物的躯干下放置一块卷起的纱布以抬高其后躯。

在开始注射之前，通过在该区域轻轻涂抹棉尖和杉三角形来清除脊髓窗口中的任何血液或脑脊液，注意不要侮辱脊髓。此外，通过在脊柱窗口的侧面放置一小块可吸收的棉花，在窗口周围形成屏障，以防止连续出血或脑脊液渗漏阻塞注射部位。对于直接注射到脊髓中，使用玻璃注射针的尖端通过识别脊动脉来近似脊髓的中线。

接下来，将针头放在C5层的后方，位于近似中线处，并将其用作参考点。然后，使用微型机械手将针头横向向右移动0.3毫米并降低针头，直到它刚好接触脊髓表面。从这个深度，插入针头。

0.6毫米进入脊髓。以每分钟250纳升的速度注射一微升携带Cre重组酶基因的逆转录腺相关病毒。然后等待两分钟，让病毒扩散到脊髓中，然后慢慢抽出针头。

此处显示了表达 Cre 依赖性 DREADDs mCherry 与对侧脊柱注射 retro Cre 共同注射的脑冠状部分运动皮层中五层皮质脊髓束神经元的标记。能够靶向特定的神经元群体将有助于描绘驱动恢复的细微差别，并为治疗发育中的神经系统中潜在的脊髓损伤提供更高的准确性。这种方法为我们研究使用兴奋性DREADDs作为治疗幼年大鼠脊髓损伤的手段的可行性铺平了道路。