该技术的总体目标是评估基因表达操作对体内皮质神经元结构的影响。与基于中性电穿孔的机型不同，我们这一程序的第一个关键优势是精细地控制基因表达水平。具体来说，这种集成的管道能够对缺陷进行体内评估，通过基因表达对神经元细胞结构控制上的小变化来提升缺陷。
此外，移植试验的配对结构允许大量减少动物数量，以获得统计学上显著的结果。该技术利用了来自Tau EGFP转基因胚胎的前体池。此池被细分为两个子池，这些子池另外会感染两个扁病毒混合物。
获取将共同注入的绿色测试池和黄色控制池。经过两天的体外扩张后，产生的神经球体分离，一对一混合，并在小鼠心室空间中注入毛细管。十天后，对日冕部分进行免疫荧光，以便测试和控制神经元之间的比较。
最后，对免疫区段进行成像和骨架化，以最终评估形态参数。在体内移植之前，准备前体绿色池。E12.5胚胎，从以前与Tau EGFP创始人交配的怀孕大坝中采集，在PBS溶液中多孔板的单个孔中。
在蓝光灯下通过目视检查快速对它们进行基因检测。分离解剖的绿色皮质与单细胞。在增殖介质中重新挂起细胞，并将它们细分为两个大小相等的子池。
感染每个子池与专用的扁病毒混合物。每个混合包含红色标签病毒或黑色控制病毒。以及病毒的 Tet-Off 驱动转基因或控制表达式，分别。
每一扁病毒必须在感染8的多重性下施用。将受感染细胞以增殖介质中每毫升多氧环素2微克镀。将细胞转移到培养箱，并在37度下离开细胞2天。
2 天后，两个子池必须显示为小神经球的悬浮液。均匀地表达红色荧光蛋白，或不。前体工程后，为P0白实验室幼崽的移植设置一个评估阵列。
使用永恒和内径分别等于 1.5 毫米和 1.12 毫米的硅酸盐玻璃毛细管。使用 P1000 拉拔器拉动毛细管。首先，输入拉拔程序。
其次，将毛细管放入支架并拧紧支架。第三，启动程序，采取两个拉微帽。在立体显微镜下用手切割毛细管尖端，以获得外径为 200-250 微米的尖端。
最后，将毛细管放在封闭的培养皿中的塑料支撑上，将其转移到引擎盖下。消毒光纤，并把它们放在引擎盖下。混合 EGTA 和快速绿色主混合，准备细胞示踪剂解决方案，并再次放在引擎盖下。
切割小块实验室密封膜，用于细胞悬浮液斑点。最后，准备一个溶液1毫克每毫升无菌多氧环素处置在0.3毫升注射器。注射管由两个乳胶管组成。
将硬塑料嘴片固定到乳胶管的一端。然后，将毛细管支架固定到另一个乳胶管的一端。从 0.45 微米无菌过滤器连接两个乳胶管的释放端，作为防止操作员细菌的屏障。
将产生的吸气管组件放在塑料支架上，以保存在发动机罩下。在单独的管中收集、测试和控制神经球。离心神经球悬浮液，用PBS代替上一代。
重复此序列两次。离心神经球悬浮液，用三辛溶液取代上流剂，并移液细胞颗粒上下，4，5倍。将细胞留在培养箱中五分钟，以获得单个细胞悬浮液。
用三辛抑制剂溶液阻断尝试蛋白酶。离心细胞，并在新鲜增殖介质中重新悬浮。计算两个池的细胞，并在增殖介质中，将细胞浓度调整为每微升10万个细胞。
然后，混合测试和控制细胞1:1，并在荧光显微镜下检查产生的混合物。最后，将混合物放在冰罩下。在远离手术操作区的地方的桌子上，与母亲和幼崽一起准备笼子。
将恢复笼放在购物车上。把从母亲笼子里取来的锯末混合物放在它的底部，把回收笼放在灯下。此外，设置一个冰盒覆盖铝箔麻醉P0幼崽。
就在移植之前，在一卷细胞悬浮液中加入1至10体积的细胞示踪剂溶液，并在一块实验室密封膜上点出3微升所产生的混合物。将小狗放在冷却的铝箔上一分钟，并检查其是否完全麻醉。同时，将3微升的喷射混合物吸入玻璃毛细管。
用70%乙醇轻轻擦拭麻醉幼崽的头部。接下来，在光纤上定位它，以清楚地识别皮质半球。将毛细管输入前部并进入心室腔。
这样做时，注意不要损害血管。为了防止对针的损害，横向旋转针头三十度。轻轻地将细胞注入腔中，并通过快速绿色监测其扩散。
等待五到十秒钟。取出玻璃针，注意不要吸气细胞悬浮液，并将其丢弃在合适的处置箱中。在幼崽从麻醉中恢复之前，在丙酮内注射150微升的多氧溶液，以保持移植后转基因表达仍然关闭。
注射后，立即将幼崽放在灯下进行恢复。把幼崽留在那里五到十分钟，一旦它们完全清醒，就把它们和妈妈放在笼子里。观察手术的幼崽两到三个小时，以确保母亲接受它们。
向笼子供应含有0.5mg/mL多氧环素和蔗糖的饮用水，以保持转基因表达。移植后四天，用无氧水更换含有多氧环素的水。从而激活后质神经元中的转基因。
将小鼠放在无氧机制中六天，并在 P10 上安乐死它们。一夜之间在4度的4%PFA中修复安乐死幼崽的大脑。拆下 PFA 溶液，用 30%蔗糖溶液更换。
将大脑保持四度，直到它们沉入小瓶底部。将大脑转移到一次性嵌入模具中，大约一半充满低温包含介质。将包含的大脑冻结在 80 度。
使用低温恒温器切割 60 微米厚的日冕部分。抗GFP、抗RFP免疫荧光的工艺部分，使用DAPI溶液进行对抗。如图所示，适当设置共合显微镜的工作参数。
收集免疫测定切片的图片，选择RFP正神经元丰富的摄影场，盲目的RFP信号分布。将图像导出为 ND2 文件，并生成其最大 z 投影作为 TIFF 文件。为了允许随后的神经元骨骼化盲细胞基因型，隐藏红色信号。
为此，请添加一个调整图层。选择级别，选择红色。将输出设置为零。
并保存文件。骨架化随后由一位新操作员执行，该操作员以前无法访问原始纯红色文件。对于每个隐藏的红色文件，打开文件，向主图像添加一个绘图图层，然后选择铅笔工具。
根据 GFP 信号跟踪某些器。然后，追踪中性。最后，保存突变层文件，包括神经元剪影。
神经骨骼的后续分析可由任一运算符执行。打开每个多层文件，创建新的空白 16 位灰度文件，背景为黑色。每个神经元一个。
复制并粘贴单个神经元剪影（从主图像）到灰度文件。回到多层文件并关闭调整层以揭示神经元基因型。保存 16 位灰度文件，注释相应的神经元基因型。
在 ImageJ 中一个导入灰度图像，并分析由 NeurphologyJ 插件的骨架。将选定的神经学J主要数据、神经学长度总面积、附着点和终点收集到电子表格中，并使用它们来计算二次形态参数。我们提出的工程协议允许与预期的转基因组合共同传递绝大多数受调查主体的神经元。
此外，它允许在转导细胞群体中实现转基因表达水平的实质性均匀性。我们程序的一个关键功能是配对配置。试验和控制前体池分别设计，混合1:1，最后共同移植。
这种成对方法将有助于检测与不同基因型特别相关的结果差异。在此示例中，我们分析了移植幼崽的冠状部分，在 Foxg1 的介入共注射十天后过度表达神经元前体和对照组。神经元群的图像是通过共和显微镜获得的。
Z 堆栈文件用于计算最大投影。神经剪影被手动跟踪。在这里，绿色和黄色剪影分别代表Foxg1过度表达和控制神经元。
最后，使用NeurphologyJ分析获得的主要参数，用于二次形态指数的计算，如图所示。这是一个简单的协议，允许研究人员评估给定基因的混合表达对体内神经铁矿发育的精细控制的影响。该协议的主要优点有两个。
在没有相应的致畸线的情况下，涉及神经元形态发生的现有基因数量可能在体内具有功能特征。分析所需的动物较少，以获得重要的统计结果。
