الهدف العام من هذه التقنية هو تقييم تأثير التلاعب بالتعبير الجيني على بنية الخلايا العصبية القشرية في الجسم الحي. ميزتنا الرئيسية الأولى من هذا الإجراء على تلك القائمة على كهرباء محايدة، هو التحكم الدقيق لمستويات التعبير الجيني. على وجه التحديد، هذا خط أنابيب متكامل تمكن في تقييم في الجسم الحي من عيب، تمجيدها من قبل تغييرات صغيرة في التعبير الجيني على السيطرة على الخلايا العصبية cytoarchitecture.
وعلاوة على ذلك، فإن هيكل الزوج من اختبار زرع يسمح لخفض كبير في أعداد الحيوانات اللازمة للحصول على نتائج ذات دلالة إحصائية. ويستفيد هذا الأسلوب من مجموعة سلائف ناشئة عن أجنة تحويلية من نوع Tau EGFP. وينقسم هذا التجمع إلى اثنين من تجمعات فرعية التي هي بدلا من المصابين مع اثنين من يمزج العدسي الفيروسية.
للحصول على تجمع اختبار أخضر و تجمع تحكم أصفر سيتم إدخاله بشكل مشترك. بعد يومين من التوسع في المختبر ، يتم فصل المجالات العصبية الناتجة ، مختلطة من واحد إلى واحد ، وحقنها مع شعرية في الفضاء البطيني الماوس. بعد عشرة أيام ، يتم تنفيذ الفلوروس المناعي على الأقسام التاجية للسماح بالمقارنة بين الخلايا العصبية الاختبارية والتحكم فيها.
وأخيراً، يتم تصوير الأجزاء المثبطة للمناعة وتممّم هيكلها من أجل التقييم النهائي لبارامترات القياسات المورفومية. قبل زرع الجسم الحي ، قم بإعداد المسبح الأخضر. يتم تعيين الأجنة E12.5، التي تم حصادها من سد حامل تزاوج سابقا إلى مؤسس تاو EGFP، في آبار فردية من لوحة متعددة الآبار في حل PBS.
Genotype لهم بسرعة عن طريق التفتيش البصري تحت مصباح الضوء الأزرق. فصل القشريات الخضراء تشريح إلى خلايا واحدة. إعادة تعليق الخلايا في الوسيلة التكاثرية، وتقسيمها إلى اثنين من تجمعات فرعية متساوية الحجم.
تصيب كل حمام سباحة فرعي بمزيج من العدسة المخصصة. كل مزيج يحتوي على فيروس التسمية الحمراء أو فيروس مكافحة الأسود. فضلا عن الفيروسات لتيت-إيقاف التي يحركها transgene أو التعبير عنصر التحكم، على التوالي.
يجب أن تدار كل فيروس العدس في تعدد العدوى من 8. لوحة الخلايا المصابة في المتوسطة التكاثرية مع 2 ميكروغرام لكل ملليلتر من doxycycline. نقل الخلايا إلى الحاضنة وتركها لمدة يومين عند 37 درجة.
بعد يومين، يجب أن تظهر اثنين من حمامات فرعية كمواد تعليق من neurospheres الصغيرة. التعبير عن بروتين الفلورسنت الأحمر بشكل متجانس، أم لا. بعد هندسة السلائف، تعيين مجموعة تقييم لزرع في الجراء مختبر P0 الأبيض.
استخدام الشعيرات الدموية الزجاج البورسليكات مع القطر الأبدي والداخلي يساوي 1.5 ملليمتر و 1.12 ملليمتر، على التوالي. سحب شعري مع سحب P1000. أولاً، أدخل برنامج السحب.
ثانياً، ضع الشعيرات الدموية في حامليها وشدها. ثالثا ، بدء تشغيل البرنامج واتخاذ اثنين من سحب microcapillaries. قطع طرف شعري، باليد مع مشرط، تحت منظار مجسم للحصول على طرف مع قطر خارجي من 200-250 ميكرومتر.
وأخيرا، ضع الشعيرات الدموية على دعم البلاستيك في طبق بيتري مغلق، ونقله تحت غطاء محرك السيارة. تطهير الألياف البصرية ووضعها تحت غطاء محرك السيارة. مزيج EGTA وسريع الأخضر الماجستير يمزج، لإعداد الحل تتبع الخلية، ووضعها مرة أخرى تحت غطاء محرك السيارة.
قطع قطع صغيرة من مختبر ختم الفيلم لاكتشاف تعليق الخلية. وأخيرا، إعداد حل من 1 مليغرام لكل ملليلتر doxycycline معقم التخلص في حقنة 0.3 ملليلتر. يتم إعداد أنبوب الحقن من أنبوبين اللاتكس.
إصلاح قطعة الفم البلاستيكية الصلبة إلى نهاية واحدة من أنبوب اللاتكس. ثم، إصلاح حامل الشعرية إلى نهاية واحدة من أنبوب اللاتكس الأخرى. قم بتوصيل النهايات الحرة لأنابيب اللاتكس من فلتر معقم 0.45 ميكرومتر، كحاجز ضد الجراثيم المشغل.
ضع تجميع أنبوب التعرق الناتج على حامل بلاستيكي ليتم الاحتفاظ به تحت غطاء محرك السيارة. جمع واختبار ومراقبة الاعصاب في أنابيب منفصلة. تعليق في الغلاف العصبي للطرد المركزي واستبدال المكبر بـ PBS.
كرر هذا التسلسل مرتين أكثر. تعليق الغلاف العصبي الطرد المركزي، استبدال فائقة بحل التربسين، والماصة بيليه الخلية صعودا وهبوطا، 4، 5 مرات. اترك الخلايا في الحاضنة لمدة خمس دقائق للحصول على تعليق خلية واحدة.
كتلة تريبسين مع محلول مثبطات التربسين. خلايا الطرد المركزي، وإعادة تعليقها في وسط الانتشارية الجديدة. عد الخلايا من اثنين من تجمعات وضبط تركيزها إلى 100،000 الخلايا في ميكرولتر، في المتوسطة التكاثرية.
ثم، خلط اختبار والسيطرة على الخلايا 1:1 والتحقق من المزيج الناتج تحت المجهر الفلوري. وأخيرا، وضع المزيج على الجليد تحت غطاء محرك السيارة. إعداد القفص مع الأم والجراء على طاولة بعيدة عن منطقة العمليات الجراحية.
ضع قفص الاسترداد على عربة. ضع خليط من نشارة نقّاصة نقّاصة النقّد المُستَخَذة من قفص الأم في قاعها، ووضع قفص التعافي تحت مصباح. جانبا، تعيين مربع الجليد التي تغطيها رقائق الألومنيوم لتخدير الجراء P0.
فقط قبل زرع، إضافة 1 إلى 10 حجم من حل تتبع الخلية إلى حجم واحد من تعليق الخلية، وبقعة ثلاثة ميكرولترات من المزيج الناتج على قطعة من مختبر ختم الفيلم. وضع الجرو على بارد، رقائق الألومنيوم لمدة دقيقة واحدة، وتحقق من أنه هو تخدير تماما. وفي الوقت نفسه، الطامح 3 ميكرولترات من مزيج الحقن في الشعيرات الدموية الزجاجية.
مسح بلطف رأس الجرو تخدير مع 70٪ الإيثانول. بعد ذلك، حدد موقعه على الألياف البصرية، لتحديد بوضوح نصفي الكرة القشرية. أدخل الشعيرات الدموية في الجبهة والوصول إلى تجويف البطين.
أثناء القيام بذلك، وإيلاء الاهتمام بعدم تلف الأوعية الدموية. لمنع الضرر من سماحة العقدية، تدوير الإبرة بشكلٍ جانبي بثلاثين درجة. حقن بلطف الخلايا في تجويف ورصد انتشارها عن طريق الأخضر السريع.
انتظر لمدة خمس إلى عشر ثوانٍ. إزالة إبرة الزجاج، مع الحرص على عدم التعرق تعليق الخلية، والتخلص منه في سلة التخلص المناسبة. قبل استرداد الجرو من التخدير ، حقن 150 ميكرولترات من محلول دوككسي داخل الصفاق ، للحفاظ على التعبير المعدل وراثيا لا يزال خارج بعد الزرع.
بعد الحقن، ضع الجراء مباشرة تحت المصباح للتعافي. اترك الجراء هناك لمدة خمس إلى عشر دقائق ، وبمجرد أن يكونوا مستيقظين تمامًا ، ضعهم في القفص مع الأم. مراقبة الجراء التي تعمل لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات، لضمان أن الأم تقبل لهم.
تزويد القفص مع مياه الشرب التي تحتوي على 0.5mg/mL دوكسيسيكلين وسوكروز, للحفاظ على التعبير المعدلة وراثيا قبالة. استبدل الـ doxycycline الذي يحتوي على الماء بمياه خالية من الـ بعد أربعة أيام من الزراعة. وبالتالي تفعيل الجينات عبر في الخلايا العصبية ما بعد التشنج.
إبقاء الفئران في نظام خال من دوكسي لمدة ستة أيام، والقتل الرحيم لهم في P10. إصلاح العقول من الجراء القتل الرحيم في 4٪ PFA، في أربع درجات، بين عشية وضحاها. إزالة حل PFA واستبداله مع محلول السكروز 30٪.
اترك الأدمغة عند أربع درجات حتى تغرق إلى قاع القارورة. نقل العقول إلى قالب التضمين المتاح ما يقرب من نصف مليئة متوسطة إدراج التبريد. تجميد الدماغ وشملت في 80 درجة.
قطع 60 ميكرون أقسام إكليل سميكة باستخدام التبريد. أقسام عملية لمكافحة GFP، ومكافحة RFP immunofluorescence ومضادة لهم مع حل DAPI. تعيين المعلمات العمل من المجهر confocal بشكل مناسب كما هو مبين.
جمع صور لشرائح مناعية، واختيار GFP إيجابية حقول التصوير الفوتوغرافي الغنية بالخلايا العصبية أعمى من توزيع إشارة RFP. تصدير الصور كملفات ND2 وإنشاء الإسقاطات z الأقصى منها كملفات TIFF. للسماح للهيكل العظمي العصبية اللاحقة أعمى من الخلايا الجينية، إخفاء إشارة حمراء.
للقيام بذلك، إضافة طبقة معايرة. حدد المستويات، حدد الأحمر. تعيين الإخراج إلى صفر.
وحفظ الملف على هذا النحو. يتم تنفيذ الهيكل العظمي في وقت لاحق من قبل مشغل جديد ، الذي لم يكن لديه حق الوصول السابق إلى الملفات الحمراء العادية الأصلية. لكل ملف أحمر مخفي، افتح الملف، وأضف طبقة رسم إلى الصورة الأساسية، وحدد أداة القلم الرصاص.
تتبع سومر على أساس إشارة GFP. ثم، تتبع نيوريت. وأخيرا، حفظ ملف mutlilayer، بما في ذلك الصور الظلية العصبية.
ويمكن إجراء تحليل لاحق من الهياكل العظمية العصبية من قبل أي من المشغلين. فتح كل ملف mulitlayer، إنشاء ملفات جديدة فارغة 16 بت الرمادي مع خلفية سوداء. واحد لكل خلية عصبية
نسخ ولصق الصور الظلية العصبية واحدة، من الصورة الأساسية، إلى ملفات تدرج الرمادي. نعود إلى ملف متعدد الطبقات وإيقاف طبقة التكيف لكشف النقاب عن الأنماط الجينية العصبية. حفظ الملفات الرمادية 16 بت، وإملاء على الخلايا العصبية المقابلة النماذج الجينية.
استيراد الصور الرمادية في ImageJ واحدا تلو الآخر ، وتحليل الهياكل العظمية من قبل البرنامج المساعد NeurphologyJ. جمع بيانات أساسية مختارة من NeurophologyJ، إجمالي مساحة طول نيوريت، نقاط المرفق ونقاط النهاية، في جدول بيانات، وتوظيفها لحساب معلمات المورفوميتري الثانوية. البروتوكول الهندسي نقترح يسمح cotransduce الغالبية العظمى من الخلايا العصبية موضوع التحقيق، مع مجموعات transgenes المقصود.
وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح لتحقيق التجانس كبير من مستويات التعبير عبر في داخل مجموعة الخلايا المستحثة. ومن السمات الرئيسية للإجراءات لدينا، هو انها تكوين الاقتران. يتم هندسة اختبار و مجموعة السلائف التحكم بشكل منفصل، مختلطة 1:1، وأخيرا شارك في زرعها.
وسييسر هذا النهج المقترن الكشف عن الاختلافات في النتائج المرتبطة على وجه التحديد بالأنماط الجينية المتميزة. في هذا المثال، قمنا بتحليل أقسام الإكلالية من الجراء المزروعة، بعد عشرة أيام من الحقن المشترك التدخلي لـ Foxg1 المفرط في التعبير عن السلائف العصبية والتحكم فيها. تم الحصول على صور لمجموعات من الخلايا العصبية مع المجهر confocal.
تم استخدام ملفات المكدس Z لحساب الإسقاطات القصوى. تم تتبع الصور الظلية العصبية يدويا. هنا ، تمثل الصور الظلية الخضراء والصفراء Foxg1 الإفراط في التعبير والسيطرة على الخلايا العصبية ، على التوالي.
وأخيراً، استخدمت البارامترات الأولية التي حصل عليها تحليل نيورفولوجيا جيه لحساب المؤشرات الثانوية للمورومترات، كما هو موضح. هذا هو بروتوكول بسيط الذي يسمح للباحث لتقييم الأثر الذي التعبير المختلط من جين معين، قد تمارس على السيطرة الدقيقة من دارث التنمية نيوريت في الجسم الحي. والمزايا الرئيسية لهذا البروتوكول هما.
عدد الموجود من الجينات المشاركة في تكوين الخلايا العصبية قد تكون تتميز وظيفيا في الجسم الحي، في غياب خطوط المسخ المقابلة. وهناك حاجة إلى عدد أقل من الحيوانات للتحليل للحصول على النتائج الإحصائية الهامة.
