この技術の全体的な目的は、生体内の皮質神経細胞アーキテクチャに対する遺伝子発現操作の効果の評価である。中性エレクトロポレーションに基づくものに対するこの手順の最初の重要な利点は、遺伝子発現レベルの細かい制御です。具体的には、この統合パイプラインは、ニューロン細胞アーキテクチャの制御上の遺伝子発現の小さな変化によって高揚欠陥のin vivo評価を可能にする。
さらに、移植検査の対構造は統計的に有意な結果を得るために必要な動物数の巨大な減少を可能にする。この技術は、タウEGFPトランスジェニック胚由来の前駆体プールを利用する。このプールは、2 つのレンチウイルスミックスに感染する 2 つのサブ プールに分けられます。
緑のテスト プールと、共注入される黄色のコントロール プールを取得します。2日間のインビトロ拡張の後、得られた神経球は、関連付けを解除し、1対1で混合し、マウス心室空間に毛細血管を注入する。10日後、冠状動脈切片の免疫蛍光が行われ、検査と制御ニューロンの比較が可能となる。
最後に、免疫染色されたセクションは、モルフォメトリクスパラメータの最終評価のために画像化および骨格化される。インビボ移植の前に、前駆体グリーンプールを準備する。以前にタウEGFPの創設者に交配された妊娠中のダムから収穫されたE12.5胚は、PBS溶液中のマルチウェルプレートの個々の井戸にセットされている。
青色光灯下で目視検査を行い、素早くジェノタイプを行います。解剖された緑色の皮質を単一細胞に関連付け解除する。増殖培地中の細胞を再中断し、2つの等しいサイズのサブプールに細分化する。
専用のレンチウイルスミックスで各サブプールに感染します。各ミックスは、赤いラベルウイルスや黒コントロールウイルスが含まれています。Tet-Off駆動トランスジーンまたはコントロール発現に対するウイルスと同様に、それぞれ。
各レンチウイルスは、感染の多重性8で投与されなければならない。感染した細胞を、ドキシサイクリン1ミリリットル当たり2マイクログラムの増殖培地に入れなさい。細胞を培養器に移し、37度で2日間放置します。
2日後、2つのサブプールは小さな神経球の懸濁液として現れなければならない。赤色蛍光タンパク質を均質に発現するかしないか。前駆体の工学の後、P0白色の実験室の子犬の移植のための評価配列を設定する。
ボロケイ酸ガラスの毛細血管を、それぞれ1.5ミリメートルと1.12ミリメートルに等しい永遠の直径と内径で使用します。P1000プーラーでキャピラリーを引っ張ります。まず、引っ張るプログラムを入力します。
第二に、キャピラリーをホルダーに入れ、締めます。3つ目は、プログラムを開始し、2つの引っ張られたマイクロキャピラーを取ります。毛細管先端をメスで手で切り、実体顕微鏡下で、外径200~250マイクロメートルの先端を得る。
最後に、密閉したペトリ皿の中にプラスチック製の支柱に毛細血管を置き、ボンネットの下に移します。光ファイバーを消毒し、ボンネットの下に置きます。EGTAとファストグリーンのマスターミックスを混ぜて、セルトレーサー溶液を準備し、ボンネットの下に再び置きます。
細胞懸濁液スポッティング用の実験室用シーリングフィルムの小片をカットします。そして最後に、0.3ミリリットルシリンジに配置したミリリットルの滅菌ドキシサイクリン当たり1ミリグラムの溶液を調製する。注入の管は2つのラテックス管から準備される。
硬いプラスチック製の口の部分をラテックスチューブの一方の端に固定します。次に、キャピラリーホルダーを他のラテックスチューブの一方の端に固定します。オペレータ細菌に対する障壁として、0.45マイクロメートルの滅菌フィルターから2つのラテックスチューブの自由端を接続します。
得られたアスピレーターチューブアセンブリをプラスチックホルダーの上に置き、ボンネットの下に保管します。別々のチューブで神経球を収集、テスト、制御します。遠心分離神経球懸濁液とPBSによって上清を置き換えます。
このシーケンスをさらに 2 回繰り返します。遠心分離機神経球懸濁液は、トリプシン溶液により上清を交換し、細胞ペレットを上下にピペットして、4,5回行う。インキュベーターに細胞を5分間放置し、単一の細胞懸濁液を得る。
トリプシン阻害剤溶液でトリプシンをブロックします。遠心分離細胞は、新たな増殖培地に再懸濁した。2つのプールの細胞を数え、増殖培地中の1マイクロリットル当たり100,000細胞に濃度を調整する。
次に、試験細胞と対照細胞1:1を混合し、得られた混合を蛍光顕微鏡で確認する。最後に、ボンネットの下の氷の上にミックスを置きます。母親と子犬と一緒にケージを準備し、外科手術領域から遠く離れたテーブルの上に。
カートに回復ケージを置きます。母親のケージから採取したおがくずを底に置き、回収ケージをランプの下に置きます。脇に、P0の子犬の麻酔のためのアルミ箔で覆われたアイスボックスを置きます。
移植の直前に、1〜10体積の細胞トレーサー溶液を1体積の細胞懸濁液に加え、得られた混合物の3マイクロリットルを実験室のシーリングフィルムに入れる。子犬を冷たいアルミホイルの上に1分間置き、完全に麻酔が付いされていることを確認します。一方、3マイクロリットルの注入をガラスキャピラリーに吸引する。
麻酔した子犬の頭を70%エタノールで静かに拭きます。次に、光ファイバー上に位置し、皮質半球を明確に同定する。前部に毛細血管を入れ、心室の空洞にアクセスする。
それをしながら、血管を損傷しないように注意してください。神経節性のエミネンスの損傷を防ぐために、針を横に30度回転させます。細胞を空洞に静かに注入し、高速グリーンによる拡散を監視します。
5 秒から 10 秒待ちます。ガラス針を取り外し、細胞懸濁液を吸引しないようにし、適当な処分ビンに廃棄する。麻酔から回復する前に、150マイクロリットルのドキシ溶液を腹腔内に注入し、移植後もトランスジェニック発現をオフに保つ。
注射後、子犬をランプのすぐ下に置いて回復します。子犬は5〜10分間そこに残し、彼らが完全に目を覚ましたら、母親と一緒にケージに入れます。母親がそれらを受け入れることを確実にするために、2〜3時間手術された子犬を観察してください。
0.5mg/mLドキシサイクリンとスクロースを含む飲料水をケージに供給し、トランスジェニック発現をオフに維持します。水を含むドキシサイクリンを、移植の4日後にドキシフリー水に交換してください。このようにポストミトティックニューロンにおけるトランス遺伝子を活性化する。
マウスを6日間ドキシフリーの体制に保ち、P10で安楽死させる。4%PFAで安楽死した子犬から脳を一晩4度で固定します。PFA溶液を取り出し、30%スクロース溶液に交換してください。
彼らはバイアル底に沈むまで4度で脳を残します。脳を、クライオ包み込み培地で満たされた使い捨て型に移します。含まれる脳を80度でフリーズします。
クライオスタットを使用して、厚さ60ミクロンのコロナセクションをカットします。抗GFP、抗RFP免疫蛍光および逆染色のためのセクションをDAPI溶液で処理します。共焦点顕微鏡の作業パラメータを図示に応じて適宜設定する。
RFPシグナル分布の盲目のGFP陽性ニューロンリッチ写真場を選択し、免疫測定スライスの写真を収集します。イメージを ND2 ファイルとしてエクスポートし、TIFF ファイルとしてそれらの最大 Z 投影を生成します。細胞遺伝子型のその後のニューロンの骨格化ブラインドを可能にするには、赤い信号を隠す。
これを行うには、調整レイヤーを追加します。レベルを選択し、赤を選択します。出力をゼロに設定します。
そして、そのようにファイルを保存します。スケルトン化は、元のプレーンな赤いファイルに以前アクセスがなかった新しいオペレータによって実行されます。非表示の赤いファイルごとに、ファイルを開き、プライマリ イメージに描画レイヤを追加して、鉛筆ツールを選択します。
GFP 信号に基づいて、サマーをトレースします。次に、神経突起をトレースします。最後に、ニューロンのシルエットを含むマルチレイヤー ファイルを保存します。
ニューロン骨格の後続の解析は、どちらのオペレータでも行うことができる。各マルチレイヤ ファイルを開き、黒の背景を持つ新しい空の 16 ビットグレースケール ファイルを作成します。ニューロンごとに1つ。
プライマリ イメージからグレースケール ファイルに、単一のニューロンのシルエットをコピーして貼り付けます。多層ファイルに戻り、調整レイヤーをオフにして神経遺伝子型を明らかにします。16 ビットのグレースケール ファイルを保存し、対応するニューロンの遺伝子型に対して名前を付けます。
ImageJでグレースケール画像を1つずつインポートし、NeurphologyJプラグインでスケルトンを分析します。選択したNeurophologyJのプライマリデータ、ニューライト長さの総面積、アタッチメントポイント、終点をスプレッドシートに収集し、それらを使用して二次形態測定パラメータを計算します。我々が提案する工学プロトコルは、意図されたトランス遺伝子セットと、調査の対象となるニューロンの大部分を一緒に変換することを可能にする。
さらに、トランスジタナイズされた細胞集団内のトランスジーン発現レベルの実質的な均一性を達成することを可能にする。私たちの手順の重要な特徴は、ペアリングされた構成です。テストとコントロール前駆体プールは別々に設計され、1:1を混合し、最終的に共同移植される。
この対になったアプローチは、特異的に異なる遺伝子型にリンクされた結果差の検出を容易にする。この例では、Foxg1過剰発現ニューロン前駆体および制御ニューロンの脳室間共注射から10日後に、移植された子犬の冠状動脈切片を分析した。ニューロンのグループの画像は共焦点顕微鏡で取得した。
Z スタック ファイルは、最大投影法の計算に使用されました。ニューロンのシルエットを手動でトレースした。ここでは、緑と黄色のシルエットはそれぞれFoxg1過剰発現ニューロンと制御ニューロンを表します。
最後に、NeurphologyJ解析によって得られた一次パラメータを、図示されるように二次形態測定指標の計算に用いた。これは、研究者が所定の遺伝子の混合発現がインビボでの神経突起発生の微細制御に及ぼす影響を評価することを可能にする単純なプロトコルである。このプロトコルの主な利点は2です。
神経形態形成に関与する既存の数の遺伝子は、対応する催奇形線の存在下で、機能的に生体内で特徴づけることができる。また、有意な統計的結果を得るために分析に必要な動物は少なくなります。
