L'obiettivo generale di questa tecnica è la valutazione dell'effetto delle manipolazioni dell'espressione genica sull'architettura neuronale corticale in vivo. Il nostro primo vantaggio chiave di questa procedura rispetto a quelli basati su un'elettroporazione neutra, è il controllo fine dei livelli di espressione genica. Nello specifico, questa pipeline integrata consente la valutazione in vivo del difetto, esaltata da piccoli cambiamenti nell'espressione genica sul controllo della citoarchitettura neuronale.
Inoltre, la struttura a coppie del test di trapianto consente un'enorme riduzione del numero di animali necessaria per ottenere risultati statisticamente significativi. La tecnica sfrutta un pool precursore proveniente da embrioni transgenici Tau EGFP. Questa piscina è suddivisa in due sottocomacchi che sono in alternativa infettati da due miscele lentivirali.
Per ottenere un pool di test verde e un pool di controllo giallo che verrà co-iniettato. Dopo due giorni di espansione in vitro, le sfere neurologiche risultanti vengono dissociate, mescolate una a una e iniettate con un capillare nello spazio ventricolare del topo. Dieci giorni dopo, viene eseguita l'immunofluorescenza sulle sezioni coronali per consentire il confronto tra i neuroni di test e controllo.
Infine, le sezioni immunostained vengono immagini e scheletrate per la valutazione finale dei parametri morfometrici. Prima del trapianto in vivo, preparare la piscina verde precursore. Gli embrioni E12.5, raccolti da una diga incinta precedentemente accoppiata a un fondatore di Tau EGFP, sono incastonati in singoli pozzi di una piastra multi-pozzo in soluzione PBS.
Genotipi rapidamente mediante ispezione visiva sotto una lampada a luce blu. Dissociare le cortici verdi sezionate in singole cellule. Sospendere di nuovo le celle in un supporto proliferatore e suddividerle in due sottocomigruppo di dimensioni uguali.
Infettare ogni sotto-piscina con un mix lentivirale dedicato. Ogni mix contiene virus con etichetta rossa o virus di controllo nero. Così come i virus per il transgene o l'espressione di controllo guidata da Tet-Off, rispettivamente.
Ogni lentivirus deve essere somministrato a molteplicità di infezione di 8. Placcare le cellule infette in mezzo proliferativo con 2 microgrammi per millilitro di doxiciclina. Trasferire le cellule nell'incubatrice e lasciarle per 2 giorni a 37 gradi.
Dopo 2 giorni, le due sottocome pozze devono apparire come sospensioni di piccole neurosfere. Esprimere in modo omogeneo la proteina fluorescente rossa, o no. Dopo l'ingegneria dei precursori, impostare un array di valutazione per il trapianto nei cuccioli di laboratorio bianchi P0.
Utilizzare i capillari in vetro borosilicato con diametro eterno e interno pari rispettivamente a 1,5 millimetri e 1,12 millimetri. Tirare il capillare con un estrattore P1000. Per prima cosa, inserisci il programma di trazione.
In secondo luogo, posizionare il capillare nei supporti e stringerli. In terzo luogo, avviare il programma e prendere i due microcapillari tirati. Tagliare la punta capillare, a mano con un bisturi, sotto lo stereomicroscopio per ottenere una punta con un diametro esterno di 200-250 micrometri.
Infine, posizionare i capillari sul supporto di plastilina in una piastra di Petri chiusa e trasferirli sotto il cofano. Disinfettare le fibre ottiche e posizionarle sotto il cofano. Mescolare le miscele master EGTA e Fast Green, per preparare la soluzione di tracciante cellulare e posizionarla di nuovo sotto il cofano.
Tagliare piccoli pezzi di pellicola di tenuta di laboratorio per l'avvistamento delle sospensioni cellulari. E infine, preparare una soluzione di 1 milligrammo per millilitro di doxiciclina sterile smaltita in una siringa da 0,3 millilitro. Il tubo di iniezione viene preparato da due tubi di lattice.
Fissare un bocchino in plastica dura a un'estremità di un tubo di lattice. Quindi, fissare il supporto capillare a un'estremità dell'altro tubo di lattice. Collegare le estremità libere dei due tubi di lattice da un filtro sterile da 0,45 micrometri, come barriera contro i germi dell'operatore.
Posizionare l'assieme del tubo aspiratore risultante su un supporto di plastilina da tenere sotto il cofano. Raccogliere, testare e controllare le neurosfere in tubi separati. La neurosfera centrifuga le sospensioni e sostituisce il supernatante con pbs.
Ripetere questa sequenza altre due volte. Centrifugare le sospensioni della neurosfera, sostituire il supernatante con la soluzione di tripina e pipettare il pellet cellulare su e giù, 4, 5 volte. Lasciare le cellule nell'incubatrice per cinque minuti per ottenere una singola sospensione cellulare.
Bloccare la tripina con soluzione inibitore della tripina. Centrifugare le cellule e sospenderle di nuovo in mezzo proliferatore fresco. Contare le cellule dei due pool e regolarne la concentrazione a 100.000 cellule per microlitro, in mezzo proliferatore.
Quindi, mescolare le cellule di prova e controllo 1:1 e controllare la miscela risultante al microscopio a fluorescenza. Infine, posizionare il mix sul ghiaccio sotto il cofano. Preparare la gabbia con la madre e i cuccioli su un tavolo lontano dalla zona operatoria chirurgica.
Metti una gabbia di recupero su un carrello. Metti una miscela di segatura prelevata dalla gabbia della madre sul fondo e metti la gabbia di recupero sotto una lampada. A parte, imposta una ghiacciaia coperta da un foglio di alluminio per l'anestesia dei cuccioli P0.
Appena prima del trapianto, aggiungere un volume da 1 a 10 di soluzione di tracciante cellulare a un volume di sospensione cellulare e individuare tre microlitri del mix risultante su un pezzo di pellicola di tenuta di laboratorio. Posizionare il cucciolo sul foglio di alluminio fresco per un minuto e verificare che sia completamente anestetizzato. Nel frattempo, aspirare i 3 microlitri di iniezione mescolare nel capillare di vetro.
Pulire delicatamente la testa del cucciolo anestetizzato con il 70% di etanolo. Successivamente, individuarlo sulla fibra ottica, per identificare chiaramente gli emisferi corticali. Entra nel capillare nella parte anteriore e accedi alla cavità ventricolare.
Mentre lo fai, presta attenzione a non danneggiare i vasi sanguigni. Per prevenire danni all'eminenza ganglionica, ruotare l'ago lateralmente di trenta gradi. Iniettare delicatamente le cellule nella cavità e monitorarne la diffusione per mezzo di Fast Green.
Aspetta da cinque a dieci secondi. Rimuovere l'ago di vetro, facendo attenzione a non aspirare la sospensione cellulare e scartarla in un bidone di smaltimento adatto. Prima del recupero dei cuccioli dall'anestesia, iniettare 150 microlitri di soluzione doxy intraperitonealmente, per mantenere l'espressione transgenica ancora spenta dopo il trapianto.
Dopo l'iniezione, posizionare immediatamente i cuccioli sotto la lampada per il recupero. Lascia i cuccioli lì per cinque o dieci minuti e, una volta che sono completamente svegli, mettili nella gabbia con la madre. Osserva i cuccioli operati per due o tre ore, per assicurarti che la madre li accetti.
Fornire alla gabbia acqua potabile contenente 0,5 mg/mL di doxiciclina e saccarosio, per mantenere disattivata l'espressione transgenica. Sostituire la doxiciclina contenente acqua con acqua priva di ossossidi quattro giorni dopo il trapianto. Attivando così il trans-gene nei neuroni postmitotici.
Tenere i topi in un regime privo diossidi per sei giorni ed eutanasiarli a P10. Riparare i cervelli dai cuccioli eutanasiati nel 4%PFA, a quattro gradi, durante la notte. Rimuovere la soluzione PFA e sostituirla con una soluzione di saccarosio al 30%.
Lasciare il cervello a quattro gradi fino ad affondare sul fondo del flaconcino. Trasferire il cervello in uno stampo di incorporamento usa e getta circa la metà riempito con mezzo di crio-inclusione. Congelare il cervello incluso a 80 gradi.
Tagliare sezioni coronali spesse 60 micron usando un criostato. Sezioni di processo per immunofluorescenza anti-GFP, anti-RFP e controsostenirle con soluzione DAPI. Impostare i parametri di lavoro del microscopio confocale in modo appropriato, come mostrato.
Raccogli immagini di fette immunosonalisi, selezionando campi fotografici positivi ricchi di neuroni GFP ciechi di distribuzione del segnale RFP. Esportare le immagini come file ND2 e generarne il numero massimo di proiezioni z come file TIFF. Per consentire la successiva scheletrizzazione neuronale cieca del genotipo cellulare, nascondere il segnale rosso.
A tale fine, aggiungere un livello di regolazione. Selezionare i livelli, selezionare rosso. Impostare l'output su zero.
E salvare il file in quanto tale. La scheletrizzazione viene successivamente eseguita da un nuovo operatore, che non aveva accesso precedente ai file rossi semplici originali. Per ogni file rosso nascosto, aprite il file, aggiungete un livello di disegno all'immagine principale e selezionate lo strumento matita.
Traccia l'somer sulla base del segnale GFP. Quindi, traccia i neuriti. Infine, salva il file del mutlilayer, comprese le sagome neuronali.
L'analisi successiva degli scheletri neuronali può essere eseguita da entrambi gli operatori. Aprite ogni file mulitlayer, create nuovi file vuoti in scala di grigi a 16 bit con sfondo nero. Uno per neurone.
Copiare e incollare singole siluenze neuronali, dall'immagine primaria, ai file in scala di grigi. Torna al file multistrato e disattiva il livello di regolazione per svelare i genotipi neuronali. Salvare i file in scala di grigi a 16 bit, annotando i genotipi neuronali corrispondenti.
Importare immagini in scala di grigi in ImageJ una per una e analizzare gli scheletri tramite il plug-in NeurphologyJ. Raccogliere i dati primari selezionati di NeurofrologiaJ, l'area totale della lunghezza della neurite, i punti di attacco e i punti finali, in un foglio di calcolo e impiegarli per calcolare parametri morfometrici secondari. Il protocollo ingegneristico che proponiamo consente di cotradurre la stragrande maggioranza dei neuroni oggetto di indagine, con i set di transgeni previsti.
Inoltre, consente di raggiungere una sostanziale omogeneità dei livelli di espressione transgena all'interno della popolazione cellulare trasdutta. Una caratteristica chiave della nostra procedura, è la sua configurazione accoppiata. Un test e un pool di precursori di controllo sono progettati separatamente, mescolati 1:1 e infine co-trapiantati.
Questo approccio accoppiato faciliterà l'individuazione delle differenze di risultati specificamente legate a genotipi distinti. In questo esempio, abbiamo analizzato sezioni coronali di cuccioli trapiantati, dieci giorni dopo la co-iniezione intervenicolare dei precursori dei neuroni e di quelli di controllo che esprimono troppo Foxg1. Le immagini di gruppi di neuroni sono state acquisite con microscopia confocale.
I file dello stack Z sono stati utilizzati per calcolare il numero massimo di proiezioni. Le sagome neuronali sono state tracciate manualmente. Qui, le sagome verdi e gialle rappresentano rispettivamente i neuroni foxg1 che esprimono e controllano troppo.
Infine, i parametri primari ottenuti dall'analisi neurfrologiaJ, sono stati impiegati per il calcolo degli indici morfometrici secondari, come illustrato. Questo è un semplice protocollo che consente al ricercatore di valutare l'impatto che l'espressione mista di un dato gene, può esercitare sul controllo fine dello sviluppo di neurite darth in vivo. I principali vantaggi di questo protocollo sono due.
Il numero esistente di geni coinvolti nella morfogenesi neuronale può essere funzionalmente caratterizzato in vivo, in assenza delle corrispondenti linee teratogeniche. E sono necessari meno animali per l'analisi per ottenere i risultati statistici significativi.
