O objetivo geral desta técnica é a avaliação do efeito das manipulações da expressão genética na arquitetura neuronal cortical in vivo. Nossa primeira vantagem fundamental deste procedimento sobre aqueles baseados em uma eletroporação neutra, é o controle fino dos níveis de expressão genética. Especificamente, este gasoduto integrado permite a avaliação in vivo de defeito, exaltada por pequenas mudanças na expressão genética no controle da citoarquitetura neuronal.
Além disso, a estrutura par do teste de transplante permite uma enorme redução no número de animais necessários para obter resultados estatisticamente significativos. A técnica aproveita uma piscina precursora originária de embriões transgênicos Tau EGFP. Esta piscina é subdividida em duas sublocos que são alternativamente infectados com duas misturas lentivirais.
Para obter uma piscina de teste verde e uma piscina de controle amarela que será co-injetada. Após dois dias de expansão in vitro, as esferas neurológicas resultantes são desassociadas, misturadas de uma a uma, e injetadas com um capilar no espaço ventricular do rato. Dez dias depois, a imunofluorescência nas seções coronais é realizada para permitir a comparação entre os neurônios de teste e controle.
Finalmente, as seções imunossuadas são imagens e esqueletizadas para avaliação final de parâmetros morfométricos. Antes do transplante in vivo, prepare a piscina verde precursora. Os embriões E12.5, colhidos de uma represa grávida anteriormente acoplada a um fundador da Tau EGFP, são situados em poços individuais de uma placa multi-poço em solução PBS.
Genótipo-los rapidamente por inspeção visual sob uma lâmpada azul. Desassociar os cortices verdes dissecados para células únicas. Suspenda as células em meio proliferativo e subdividir-as em duas subgruas de tamanho igual.
Infecte cada subcoo pool com uma mistura lentiviral dedicada. Cada mistura contém vírus de rótulo vermelho ou vírus de controle preto. Assim como os vírus para tet-off acionado transgene ou expressão de controle, respectivamente.
Cada lentivírus deve ser administrado na multiplicidade de infecção de 8. Aplaque as células infectadas em meio proliferativo com 2 microgramas por mililitro de doxiciclina. Transfira as células para a incubadora e deixe-as por 2 dias a 37 graus.
Após 2 dias, as duas subgrupas devem aparecer como suspensões de pequenas neuroesferas. Expressando homogeneamente a proteína fluorescente vermelha, ou não. Após a engenharia dos precursores, estabeleça uma matriz de avaliação para o transplante em filhotes de laboratório brancos P0.
Utilize os capilares de vidro borossilicato com diâmetro eterno e interno igual a 1,5 milímetros e 1,12 milímetros, respectivamente. Puxe o capilar com um puxador P1000. Primeiro, entre no programa de puxar.
Em segundo lugar, coloque o capilar nos suportes e aperte-os. Terceiro, inicie o programa e pegue os dois microcapillaries puxados. Corte a ponta capilar, à mão com um bisturi, sob o estereóscópio para obter uma ponta com diâmetro externo de 200-250 micrômetros.
Por fim, coloque os capilares no suporte de plasticina em uma placa de Petri fechada, e transfira-o sob o capô. Desinfete as fibras ópticas e coloque-as sob o capô. Misture as misturas mestre EGTA e Fast Green, para preparar a solução de rastreador de células e coloque-a novamente sob o capô.
Corte pequenos pedaços de filme de vedação de laboratório para detectar a suspensão celular. E, finalmente, prepare uma solução de 1 miligrama por mililitro estéril doxiciclina descartada em uma seringa de 0,3 mililitro. O tubo de injeção é preparado a partir de dois tubos de látex.
Fixar uma peça de boca de plástico duro em uma extremidade de um tubo de látex. Em seguida, fixar o suporte capilar em uma extremidade do tubo de látex. Conecte as extremidades livres dos dois tubos de látex a partir de um filtro estéril de 0,45 micrômetros, como uma barreira contra germes do operador.
Coloque o conjunto do tubo aspirador resultante em um suporte de plasticina a ser mantido sob o capô. Coletar, testar e controlar neuroesferas em tubos separados. Centrífuga suspensões neuroferas e substitua o supernatante por PBS.
Repita esta sequência mais duas vezes. Centrífuga suspensões neuroferas, substitua o supernante pela solução de trippsina, e pipeta a pelota celular para cima e para baixo, 4, 5 vezes. Deixe as células na incubadora por cinco minutos para obter uma suspensão de uma única célula.
Bloqueie a trippsina com a solução inibidora de trippsina. Centrífugas, e suspendê-las em meio proliferativo fresco. Conte as células das duas piscinas e ajuste sua concentração para 100.000 células por microliter, em meio proliferativo.
Em seguida, misture as células de teste e controle 1:1 e verifique a mistura resultante sob um microscópio de fluorescência. Por fim, coloque a mistura no gelo sob o capô. Prepare a gaiola com a mãe e os filhotes em uma mesa muito distante da área de operador cirúrgico.
Coloque uma gaiola de recuperação em um carrinho. Coloque uma mistura de serragem retirada da gaiola da mãe no fundo, e coloque a gaiola de recuperação sob uma lâmpada. À parte, reserve uma caixa de gelo coberta por uma folha de alumínio para a anestesia dos filhotes P0.
Pouco antes do transplante, adicione uma solução de 1 a 10 volumes de rastreador de células a um volume de suspensão celular, e localmente três microliters da mistura resultante em um pedaço de filme de vedação de laboratório. Coloque o filhote na folha de alumínio fria por um minuto e verifique se ele está totalmente anestesiado. Enquanto isso, aspire os 3 microliters de injeção misturados no capilar de vidro.
Limpe suavemente a cabeça do filhote anestesiado com 70% de etanol. Em seguida, localizá-lo na fibra óptica, para identificar claramente os hemisférios corticais. Digite o capilar na frente e acesse a cavidade ventricular.
Ao fazer isso, preste atenção para não danificar os vasos sanguíneos. Para evitar danos de eminência gangliônica, gire a agulha lateralmente em trinta graus. Injete suavemente as células na cavidade e monitore sua difusão por meio do Fast Green.
Espere de cinco a dez segundos. Retire a agulha de vidro, tomando cuidado para não aspirar a suspensão da célula, e descarte-a em uma lixeira adequada. Antes da recuperação do filhote da anestesia, injete 150 microliters de solução doxi intraperitoneal, para manter a expressão transgênica ainda fora após o transplante.
Após a injeção, coloque os filhotes imediatamente sob a lâmpada para recuperação. Deixe os filhotes lá por cinco a dez minutos, e uma vez que eles estejam totalmente acordados, coloque-os na gaiola com a mãe. Observe os filhotes operados por duas a três horas, para garantir que a mãe os aceite.
Forneça à gaiola água potável contendo doxiciclina de 0,5mg/mL e sacarose, para manter a expressão transgênica fora. Substitua a doxiciclina contendo água com água sem doxido quatro dias após o transplante. Ativando assim o trans-gene em neurônios pós-metóticos.
Mantenha os ratos em um regime livre de doxi por seis dias, e eutanize-os em P10. Conserte cérebros de filhotes eutanizados em 4% PFA, a quatro graus, durante a noite. Remova a solução PFA e substitua-a por uma solução de 30%de sacarose.
Deixe os cérebros a quatro graus até afundarem no fundo do frasco. Transfira os cérebros para um molde descartável de incorporação aproximadamente meio cheio de meio crio-inclusão. Congele o cérebro incluído a 80 graus.
Corte 60 mícrons de seções coronais grossas usando um criostat. Seções de processo para imunofluorescência anti-GFP, anti-RFP e contratensão-as com a solução DAPI. Defina os parâmetros de trabalho do microscópio confocal apropriadamente como mostrado.
Colete imagens de fatias imunoensaceradas, selecionando campos fotográficos ricos em neurônios GFP cegos da distribuição de sinal RFP. Exporte as imagens como arquivos ND2 e gere projeções máximas z deles como arquivos TIFF. Para permitir a esqueleto subsequente do neurônio cego do genótipo celular, esconda o sinal vermelho.
Para isso, adicione uma camada de ajuste. Selecione níveis, selecione vermelho. Defina a saída para zero.
E salve o arquivo como tal. A esqueleto é posteriormente realizada por um novo operador, que não tinha acesso prévio a arquivos originais vermelhos simples. Para cada arquivo vermelho oculto, abra o arquivo, adicione uma camada de desenho à imagem principal e selecione a ferramenta lápis.
Rastreie o somer com base no sinal GFP. Então, rastreie os neurites. Finalmente, salve o arquivo de mutlilayer, incluindo silhuetas neuronais.
A análise subsequente dos esqueletos neuronais pode ser realizada por qualquer operador. Abra cada arquivo mulitlayer, crie novos arquivos vazios de escala de cinza de 16 bits com fundo preto. Um por neurônio.
Copie e cole silhuetas neuronais únicas, desde a imagem primária até os arquivos em escala de cinza. Volte para o arquivo multicamadas e desligue a camada de ajuste para desvendar genótipos neuronais. Salve os arquivos em escala de cinza de 16 bits, anotando os genótipos de neurônios correspondentes.
Importe imagens em escala de cinza em ImageJ um a um, e analise esqueletos por plugin NeurphologyJ. Colete os dados primários selecionados da NeurophologyJ, área total de comprimento de neurite, pontos de apego e pontos finais, em uma planilha e empregue-os para calcular parâmetros morfométricos secundários. O protocolo de engenharia que propomos permite cotransduturar a grande maioria dos neurônios objeto de investigação, com os conjuntos de transgenes pretendidos.
Além disso, permite alcançar uma homogeneidade substancial dos níveis de expressão transgênica dentro da população celular transduzida. Uma característica fundamental do nosso procedimento, é a configuração emparelhada. Um teste e uma piscina precursora de controle são separadamente projetados, misturados 1:1, e finalmente co-transplantados.
Essa abordagem emparelhada facilitará a detecção de diferenças de resultados especificamente ligadas a genótipos distintos. Neste exemplo, analisamos seções coronais de filhotes transplantados, dez dias após a co-injeção interventricular de precursores e controle de neurônios foxg1 super-expressando. Imagens de grupos de neurônios foram adquiridas com microscopia confocal.
Arquivos Z-stack foram usados para calcular projeções máximas. As silhuetas neuronais foram traçadas manualmente. Aqui, as silhuetas verde e amarela representam os neurônios foxg1 super-expressando e controlando, respectivamente.
Por fim, foram utilizados parâmetros primários obtidos pela análise de NeurphologyJ para cálculo de índices morfométricos secundários, conforme ilustrado. Trata-se de um protocolo simples que permite ao pesquisador avaliar o impacto que a expressão mista de um determinado gene pode exercer sobre o controle fino do desenvolvimento de neurite darth in vivo. As principais vantagens deste protocolo são duas.
O número existente de genes envolvidos na morfogênese neuronal pode ser caracterizado funcionalmente in vivo, na ausência das linhas teratogênicas correspondentes. E menos animais são necessários para a análise para obter os resultados estatísticos significativos.
