达尼奥胚胎发生过程中的上眼硫可视化

这组标准化协议可用于提供对高级眼动管（SOS）的新见解，这是最近发现的发育眼结构。这些协议将允许世界各地的任何实验者在斑马鱼眼发育期间清楚地可视化 SOS。首先将异质生长分化因子六 A 雄性斑马和雌性斑马鱼放在分温器的单独两侧，在配对前一天晚上放入一罐去氯水中。

第二天早上，去除分压器，让鱼繁殖不超过30分钟。在育种期结束时，将胚胎收集到含有E3培养的培养皿中，在28.5度培养箱中孵化。在受精后20小时，用E3介质补充0.004%1-苯基-2-硫化液代替上清液，以防止色素产生，并通过光显微镜检查胚胎，以确认它们都处于适当的发育阶段。

将样品放在解剖显微镜下。丢弃任何发育不成熟的胚胎，并使用细钳子轻轻拉开胆小子。可视化 SOS，该 SOS 可能显示为眼部边缘处的缩进或线。

然后，对显示 SOS 关闭延迟的胚胎进行排序，以表示未关闭的胚胎。要使用解剖显微镜拍摄这些胚胎，请准备一个在E3介质中含有1%agarose的培养皿，轻轻刺破黄糖的中心，形成一个浅孔，将胚胎的蛋黄放入其中。然后，将麻醉胚胎横向放在阿加罗斯上。

要使用化合物或共体显微镜对胚胎进行成像，请将胚胎移植到35毫米培养皿中，其中含有一小块非凝胶1%的低熔点阿加罗斯，然后使用细钓鱼线快速将胚胎置于横向位置。当加糖冷却后，倒入足够的E3介质，以覆盖加糖，并使用20倍水浸式客观透镜可视化SS。成像后，轻轻地从胚胎中拉出甲糖，将组织固定在4%的甲醛中，或让斑马鱼继续发育。

要通过荧光mRNA表达来可视化SS，使用微注射装置在单细胞阶段将300个增强性GFP-CAX mRNA图的象形图注入胚胎。然后，使用荧光立体镜对具有明亮增强型GP表达的胚胎进行筛查，并采用一种成像方法获取胚胎图像，如所证明的。对于胚胎斑马鱼层胺的全安装免疫荧光染色，将胚胎如证明的去功能化，并在新鲜准备的4%对蛋白二甲醛的微离状管中将胚胎修复两个小时。室温摇动器上。

在固定结束时，在PBS加Tween或PBST中清洗胚胎四次，每次洗涤5分钟，然后以每毫升10微克或每毫升10微克的蛋白质酶K进行渗透5分钟。如证明，在PBST中四次清洗渗透胚胎，并在PBST中每毫升牛血清白蛋白中用5%的山羊血清和两毫克的胚胎清洗一到两个小时。在阻断孵育结束时，在摇床上一夜之间在四摄氏度的原发性抗层压素抗体中孵育胚胎。

第二天早上，每次洗涤在PBST中洗胚5次，洗涤15分钟，并在防光摇床上用适当的二级抗体在4摄氏度下过夜地给组织贴上适当的二级抗体标签。第二天早上，在PBST中清洗胚胎四次，每次洗涤15分钟，将胚胎放在含有新鲜PBST的小培养皿中。使用精细钳子，轻轻扰乱蛋黄，并通过蛋黄囊的轻微刮擦去除蛋黄细胞。

将脱卵胚胎转移到PBS中新鲜准备的30%甘油中，确保将胚胎放在溶液顶部，并尽可能少地转移先前的溶液，等待胚胎沉入管底。当胚胎到达容器底部时，在PBS溶液中将它们转移到连续的50%和70%甘油，正如刚刚证明的。胚胎沉入70%甘油容器底部后，将样品转移到一个小塑料盘中进行解剖，然后将胚胎后脑分离至后脑。

使用精细的解剖工具，用尽可能少的甘油将一个头移动到玻璃滑梯上，然后从内部轻轻地将细小针插入前脑心室，向下推，将头部的左右两半彼此分开。当头部完全从中线向下角角时，将头部中线的每一侧向下安装，眼睛侧向上。SOS在受精后20至23小时通过解剖显微镜观察，并通过差分干扰对比度成像，作为后眼的细线，将发育中的视网膜的鼻腔和时间部分分部。

此外，在眼睛的后界中可能可以看到细微的缩进。继层压素的免疫荧光染色后，细线可被确认为基膜。当 SOS 闭合延迟时，在解剖显微镜下，可以观察到其长时间存在，如眼部侧有明显的裂痕。

当使用差分干涉对比度成像在复合显微镜下观察时，这一特征在由 SOS 分隔的眼睛的鼻侧和时间侧时更加突出，在后眼中，该线清晰可见。在野生型斑马鱼受精后28小时，层压染色清楚地表明，SOS已完全关闭，使其成为监测裂变闭合延迟的理想阶段。增强型 GFP-CAX mRNA 的注入允许活体或固定胚胎的细胞膜可视化，以跟踪导致 SOS 闭合的细胞形态的变化。

可视化 SOS 可能很困难，因为它很窄且瞬态。但是，在评估以后时间点的闭合延迟时，必须保持一致的评分方法。这些技术可以与实验操作相结合，用于识别影响正确 SOS 形成和闭合的遗传因素或药理剂。