Este conjunto de protocolos de padronização pode ser usado para oferecer uma nova visão sobre o sulco ocular superior, ou SOS, uma estrutura recentemente descoberta do olho em desenvolvimento. Esses protocolos permitirão que qualquer experimentador em todo o mundo visualize claramente o SOS durante o desenvolvimento dos olhos de zebrafish. Comece colocando o fator de diferenciação de crescimento heterozigous seis Um peixe-zebra macho e fêmea em lados separados de um divisor em um tanque de água descrente na noite anterior ao seu emparelhamento.
Na manhã seguinte, remova o divisor e deixe o peixe procriar por não mais do que 30 minutos. Ao final do período de reprodução, colete os embriões em placas de Petri contendo meio E3 para sua incubação em uma incubadora de 28,5 graus. Às 20 horas após a fertilização, substitua o supernascer por E3 médio suplementado 0,004%1-Phenyl-2-thiourea para evitar a produção de pigmentos e examinar os embriões por microscopia leve para confirmar que estão todos no estágio de desenvolvimento apropriado.
Coloque as amostras sob um microscópio dissecando. Descarte quaisquer embriões imaturos de desenvolvimento e use fórceps finos para separar suavemente os acordes. Visualize o SOS, que pode aparecer como um recuo ou linha na margem dorsal do olho.
Então, classifique os embriões que mostram o atraso de fechamento do SOS daqueles que não o fazem. Para fotografar esses embriões usando um microscópio dissecando, prepare uma placa de Petri contendo 1%de agarose em E3 médio e levemente espinhoso no centro da agarose para criar um buraco raso no qual a gema do embrião pode ser colocada. Em seguida, coloque um embrião anestesiado lateralmente sobre a agarose.
Para imaginar os embriões usando um microscópio composto ou confocal, transfira um embrião para uma placa de Petri de 35 milímetros contendo um pequeno bolus de ponto de fusão não-gelado de 1% baixo em meio E3 e use linha de pesca fina para posicionar rapidamente o embrião na posição lateral. Quando a agarose tiver esfriado, despeje bastante E3 médio no prato para cobrir a agarose e use uma lente objetiva de imersão de água de 20x para visualizar o SOS. Após a imagem, puxe suavemente a agarose do embrião e fixe o tecido em 4% de paraformaldeído ou permita que o zebrafish continue seu desenvolvimento.
Para visualizar o SOS pela expressão fluorescente mRNA, use um aparelho de microinjeção para injetar 300 picogramas de mRNA GFP-CAX aprimorado em embriões no estágio de uma célula. Em seguida, use um estereoscópio fluorescente para testar embriões com expressão GFP brilhante e obter imagens dos embriões por um dos métodos de imagem, como demonstrado. Para coloração imunofluorescente de montagem total de laminina de zebrafish embrionário, descorionato os embriões como demonstrado e fixar os embriões em um tubo de microcentrifuge em recém-preparado 4% paraformaldeído por duas horas em um agitador de temperatura ambiente.
Ao final da fixação, lave os embriões quatro vezes em PBS mais Tween, ou PBST, por cinco minutos por lavagem seguido de permeabilização em 10 microgramas por mililitro ou Proteinase K à temperatura ambiente por cinco minutos. Lave os embriões permeabilizados quatro vezes em PBST como demonstrado e bloqueie os embriões em 5% de soro de cabra e dois miligramas por mililitro de albumina de soro bovino em PBST por uma a duas horas em um agitador de temperatura ambiente. No final da incubação de bloqueio, incubar os embriões no principal anticorpo anti-laminina de interesse a quatro graus Celsius durante a noite em um shaker.
Na manhã seguinte, lave os embriões cinco vezes em PBST por 15 minutos por lavagem e rotule os tecidos com um anticorpo secundário apropriado durante a noite a quatro graus Celsius no shaker protegido da luz. Na manhã seguinte, lave os embriões quatro vezes em PBST por 15 minutos por lavagem e coloque os embriões em uma pequena placa de Petri contendo PBST fresco. Usando fórceps finos, interrompa suavemente as gemas e remova as células da gema através de raspagem leve dos sacos de gema.
Transfira os embriões desolados para o recém-preparado 30% glicerol na PBS, certificando-se de colocar os embriões em cima da solução e transferir o mínimo possível da solução anterior e esperar que os embriões afundem até o fundo do tubo. Quando os embriões chegarem ao fundo do recipiente, transfira-os para 50% e 70% de glicerol sequencial em soluções PBS, como apenas demonstrado. Depois que os embriões afundarem até o fundo do recipiente de 70%, transfira as amostras para um pequeno prato plástico para dissecções e corte os embriões posteriores aos cérebros traseiros.
Usando ferramentas de dissecção finas, mova uma cabeça para um deslizamento de vidro com o mínimo de glicerol possível e insira suavemente um pino minutien fino no ventrículo de antebraína do interior, empurrando para baixo para separar as metades direita e esquerda da cabeça uma da outra. Quando a cabeça estiver completamente preenchida pela linha média, monte cada lado da linha média da cabeça para baixo, olho para cima. O SOS é observável através do microscópio dissecando em 20 a 23 horas após a fertilização e através de interferência diferencial a imagem de contraste como uma linha fina no olho dorsal que separa as metades nasais e temporais da retina em desenvolvimento.
Além disso, um recuo sutil pode ser visível no limite dorsal do olho. Após a coloração imunofluorescente da laminina, a linha fina pode ser confirmada como a membrana do porão. Quando o fechamento do SOS é adiado, sua presença prolongada pode ser observada como uma fissura pronunciada no lado dorsal do olho sob um microscópio dissecando.
Quando observada sob um microscópio composto usando imagens de contraste de interferência diferencial, essa característica é ainda mais proeminente com os lados nasais e temporais do olho separados pelo SOS, que é claramente visível como uma linha no olho dorsal. Por 28 horas após a fertilização em zebrafish de tipo selvagem, a coloração de laminina demonstra claramente que o SOS está completamente fechado, tornando este o estágio ideal para monitorar atrasos no fechamento de fissuras. A injeção de mRNA GFP-CAX aprimorado permite a visualização das membranas celulares de embriões vivos ou fixos para rastrear alterações na morfologia das células que levam ao fechamento do SOS.
Visualizar o SOS pode ser difícil, pois é estreito e transitório. No entanto, é imperativo que você mantenha um método de pontuação consistente ao avaliar atrasos de fechamento em pontos de tempo posteriores. Essas técnicas podem ser combinadas com manipulações experimentais para identificação de fatores genéticos ou agentes farmacológicos que afetam a formação e o fechamento adequados do SOS.
