Questo insieme di protocolli di standardizzazione può essere utilizzato per offrire nuove informazioni sul solco oculare superiore, o SOS, una struttura scoperta di recente dell'occhio in via di sviluppo. Questi protocolli consentiranno a qualsiasi sperimentatore in tutto il mondo di visualizzare chiaramente l'SOS durante lo sviluppo degli occhi zebrafish. Inizia posizionando il fattore di differenziazione della crescita eterozigote sei Zebrafish maschio e femmina su lati separati di un divisore in un serbatoio di acqua declorolato la sera prima del loro accoppiamento.
La mattina successiva, rimuovere il divisore e lasciare che il pesce si riprodutti per non più di 30 minuti. Alla fine del periodo di riproduzione, raccogliere gli embrioni in piastre di Petri contenenti mezzo E3 per la loro incubazione in un incubatore di 28,5 gradi. A 20 ore dalla concimazione, sostituire il supernatante con mezzo E3 integrato 0,004%1-Fenil-2-tiourea per prevenire la produzione di pigmenti ed esaminare gli embrioni con microscopia ottica per confermare che sono tutti nella fase di sviluppo appropriata.
Posizionare i campioni al microscopio di sezionamento. Scartare eventuali embrioni immaturi per lo sviluppo e utilizzare forcep fini per smontare delicatamente i coriaci. Visualizza l'SOS, che può apparire come un'indentazione o una linea al margine dorsale dell'occhio.
Quindi, ordina gli embrioni che mostrano un ritardo di chiusura dell'SOS rispetto a quelli che non lo fanno. Per fotografare questi embrioni utilizzando un microscopio sezionato, preparare una piastra di Petri contenente l'1%di agarosio nel mezzo E3 e pungere leggermente il centro dell'agarosio per creare un buco poco profondo in cui è possibile posizionare il tuorlo dell'embrione. Quindi, posizionare un embrione anestetizzato lateralmente sull'agarosio.
Per identificare gli embrioni utilizzando un microscopio composto o confocale, trasferire un embrione in una piastra di Petri di 35 millimetri contenente un piccolo bolo di agarosio a punti di fusione basso 1% non gelato nel mezzo E3 e utilizzare una lenza fine per posizionare rapidamente l'embrione nella posizione laterale. Quando l'agarosio si è raffreddato, versare abbastanza mezzo E3 nel piatto per coprire l'agarosio e utilizzare una lente obiettivo di immersione in acqua 20x per visualizzare l'SOS. Dopo l'imaging, estrarre delicatamente l'agarosio dall'embrione e fissare il tessuto in paraformaldeide al 4% o consentire al pesce zebra di continuare il suo sviluppo.
Per visualizzare l'SOS mediante espressione di mRNA fluorescente, utilizzare un apparato di microiniezione per iniettare 300 picogrammi di mRNA GFP-CAX potenziato in embrioni allo stadio di una cellula. Quindi, utilizzare uno stereoscopio fluorescente per schermare gli embrioni con un'espressione GFP migliorata brillante e ottenere immagini degli embrioni con uno dei metodi di imaging come dimostrato. Per la colorazione immunofluorescente a montaggio intero della laminina di zebrafish embrionale, dechorionare gli embrioni come dimostrato e fissare gli embrioni in un tubo di microcentrifugo in paraformaldeide al 4% preparata al momento per due ore su uno shaker a temperatura ambiente.
Al termine della fissazione, lavare gli embrioni quattro volte in PBS più Tween, o PBST, per cinque minuti per lavaggio seguito da permeabilizzazione in 10 microgrammi per millilitro o Proteinasi K a temperatura ambiente per cinque minuti. Lavare gli embrioni permeabili quattro volte in PBST come dimostrato e bloccare gli embrioni nel siero di capra al 5% e due milligrammi per millilitro di albumina di siero bovino in PBST per una o due ore su uno shaker a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione di blocco, incubare gli embrioni nell'anticorpo anti-laminide primario di interesse a quattro gradi Celsius durante la notte su uno shaker.
La mattina seguente, lavare gli embrioni cinque volte in PBST per 15 minuti per lavaggio ed etichettare i tessuti con un anticorpo secondario appropriato durante la notte a quattro gradi Celsius sullo shaker protetto dalla luce. La mattina seguente, lavare gli embrioni quattro volte in PBST per 15 minuti per lavaggio e posizionare gli embrioni in una piccola piastra di Petri contenente PBST fresco. Usando forcep fini, interrompere delicatamente i tuorli e rimuovere le cellule del tuorlo attraverso un lieve raschiamento delle sacche di tuorlo.
Trasferire gli embrioni deyolked nel 30% di glicerolo appena preparato in PBS, assicurandosi di posizionare gli embrioni sopra la soluzione e trasferendo il meno possibile la soluzione precedente e attendere che gli embrioni affondino sul fondo del tubo. Quando gli embrioni hanno raggiunto il fondo del contenitore, trasferirli al 50% sequenziale e al 70% di glicerolo nelle soluzioni PBS, come appena dimostrato. Dopo che gli embrioni sono affondati sul fondo del contenitore del 70% di glicerolo, trasferire i campioni su un piccolo piatto di plastica per la dissezione e severare gli embrioni posteriori alle hindbraine.
Utilizzando strumenti di dissezione fine, spostare una testa su uno scivolo di vetro con il meno glicerolo possibile e inserire delicatamente un perno di minuzie fine nel ventricolo del probrain dall'interno, spingendo verso il basso per separare le metà destra e sinistra della testa l'una dall'altra. Quando la testa è stata completamente raccordata lungo la linea mediana, montare ogni lato della linea mediana della testa verso il basso, lato oculare verso l'alto. L'SOS è osservabile attraverso il microscopio sezionante a 20-23 ore dopo la fecondazione e attraverso l'imaging a contrasto di interferenza differenziale come una linea sottile nell'occhio dorsale che separa le metà nasali e temporali della retina in via di sviluppo.
Inoltre, una sottile indentazione può essere visibile nel confine dorsale dell'occhio. Dopo la colorazione immunofluorescente della laminina, la linea sottile può essere confermata come membrana basale. Quando la chiusura sos è ritardata, la sua presenza prolungata può essere osservata come una pronunciata fenditura nel lato dorsale dell'occhio sotto un microscopio sezionante.
Se osservata al microscopio composto utilizzando l'imaging a contrasto di interferenza differenziale, questa caratteristica è ancora più prominente con i lati nasale e temporale dell'occhio separati dall'SOS, che è chiaramente visibile come una linea nell'occhio dorsale. Entro 28 ore dalla fecondazione in zebrafish di tipo selvatico, la colorazione laminina dimostra chiaramente che l'SOS è completamente chiuso, rendendolo il palcoscenico ideale per monitorare i ritardi nella chiusura della fessura. L'iniezione di mRNA GFP-CAX potenziato consente la visualizzazione delle membrane cellulari di embrioni vivi o fissi per tracciare i cambiamenti nella morfologia delle cellule che portano alla chiusura sos.
Visualizzare l'SOS può essere difficile, in quanto è stretto e transitorio. Tuttavia, è imperativo mantenere un metodo di punteggio coerente quando si valutano i ritardi di chiusura nei punti di tempo successivi. Queste tecniche possono essere combinate con manipolazioni sperimentali per identificare fattori genetici o agenti farmacologici che influenzano la corretta formazione e chiusura dell'SOS.
