Этот набор протоколов стандартов может быть использован, чтобы предложить новое понимание превосходного глазного сулькуса, или SOS, недавно обнаруженной структуры развивающегося глаза. Эти протоколы позволят любому экспериментатору во всем мире четко визуализировать SOS во время развития глаз зебры. Начните с размещения гетерозиготного фактора дифференциации роста 6 Самец и самка зебры на отдельных сторонах делитера в баке дехлорированной воды вечером перед их спариванием.
На следующее утро снимите разделитель и дайте рыбе размножаться не более 30 минут. В конце периода размножения, собирать эмбрионы в чашки Петри, содержащие E3 среды для их инкубации в 28,5 градусов инкубатора. В течение 20 часов после оплодотворения замените супернатант на E3 средний, дополненный 0,004%1-фенил-2-тиуреа, чтобы предотвратить выработку пигмента и изучить эмбрионы с помощью световой микроскопии, чтобы подтвердить, что все они находятся на соответствующей стадии развития.
Поместите образцы под рассечение микроскопа. Откажитесь от любых незрелых эмбрионов и используйте тонкие типсы, чтобы аккуратно разобрать хорионы. Визуализуй SOS, который может выглядеть как отступ или линия на спинной грани глаза.
Затем сортировать эмбрионы, которые показывают задержку закрытия SOS от тех, которые этого не делают. Чтобы сфотографировать эти эмбрионы с помощью рассечения микроскопа, подготовить чашку Петри, содержащую 1%agarose в E3 среды и слегка колоть центр агарозы, чтобы создать мелкое отверстие, в которое желток эмбриона может быть помещен. Затем поместите анестезироваемый эмбрион сбое на агарозу.
Чтобы изобразить эмбрионы с помощью соединения или конфокального микроскопа, перенесите эмбрион в 35-миллиметровую чашку Петри, содержащую небольшой болюс не гелеобразной точки плавления 1%low agarose в E3 medium и используйте тонкую лестню, чтобы быстро располагать эмбрион в боковом положении. Когда агароза остынет, залить достаточно E3 среды в блюдо, чтобы покрыть агарозу и использовать 20x воды погружения объектив для визуализации SOS. После визуализации, осторожно вытащить агарозу из эмбриона и исправить ткани в 4%paraformaldehyde или позволить зебры продолжать свое развитие.
Чтобы визуализировать SOS с помощью флуоресцентного экспрессии мРНК, используйте микроинъекции аппарата для введения 300 пикограмм расширенной GFP-CAX мРНК в эмбрионы на одноклеточной стадии. Затем используйте флуоресцентный стереоскоп для проверки эмбрионов с ярким улучшенным выражением GFP и получения изображений эмбрионов одним из методов визуализации, как это было продемонстрировано. Для цельно-монтажного иммунофлуоресцентного окрашивания эмбрионального ламинина зебры, дехорионат эмбрионов, как это было продемонстрировано, и фиксирует эмбрионы в микроцентрифугной трубке в свежеприготовленном 4%параформальдегиде в течение двух часов на шейкере комнатной температуры.
В конце фиксации, мыть эмбрионы четыре раза в PBS плюс Tween, или PBST, в течение пяти минут за стирку следуют протеабилизации в 10 микрограмм на миллилитр или Proteinase K при комнатной температуре в течение пяти минут. Вымойте промеабилизированные эмбрионы четыре раза в PBST, как попродемонстрировано, и блокируйте эмбрионы в сыворотке крови 5%goat и два миллиграмма на миллилитр альбумин сыворотки крупного рогатого скота в PBST в течение одного-двух часов на шейкере комнатной температуры. В конце блокирующего инкубации инкубировать эмбрионы в первичных антиламинин антитела интереса на четыре градуса по Цельсию ночь на шейкере.
На следующее утро, мыть эмбрионы пять раз в PBST в течение 15 минут за стирку и этикетки тканей с соответствующим вторичным антителом на ночь при четырех градусах по Цельсию на шейкер защищен от света. На следующее утро, мыть эмбрионы четыре раза в PBST в течение 15 минут за стирку и поместить эмбрионы в небольшой чашке Петри, содержащей свежие PBST. Используя тонкие миппы, аккуратно нарушить желтки и удалить желтковые клетки через мягкий соскабливание желтковых мешков.
Перенесите дейолкенные эмбрионы в свежеприготовленный 30%глицерол в PBS, убедившись, что поместите эмбрионы на верхней части раствора и передачи как можно меньше предыдущего решения, как это возможно, и ждать эмбрионов, чтобы опуститься на дно трубки. Когда эмбрионы достигли дна контейнера, перенесите их в последовательные 50%и 70% глицерол в решениях PBS, как только что продемонстрировано. После того, как эмбрионы опустились на дно 70%-глицерола контейнера, передать образцы в небольшой пластиковой тарелке для вскрытия и разорвать эмбрионы задней к задним сбрерам.
Используя тонкие инструменты вскрытия, переместить одну голову на стеклянную горку с как можно меньше глицерол, как это возможно, и аккуратно вставить тонкую минутин булавку в желудочек forebrain из интерьера, толкая вниз, чтобы отделить правую и левую половинки головы друг от друга. Когда голова была полностью филе вниз по средней линии, смонтировать каждую сторону головы средней линии вниз, глаз вверх. SOS наблюдается через рассечение микроскопа на 20 до 23 часов после оплодотворения и с помощью дифференциальных помех контрастной визуализации, как тонкая линия в спинном глазу, который отделяет носовые и височные половинки развивающейся сетчатки.
Кроме того, тонкий отступ может быть виден в спинной границе глаза. После иммунофлуоресцентного окрашивания ламинина тонкая линия может быть подтверждена в качестве мембраны подвала. Когда закрытие SOS задерживается, его длительное присутствие может наблюдаться как выраженная расщелина в спинной стороне глаза под рассеченным микроскопом.
При наблюдении под соединением микроскопа с использованием дифференциальных помех контрастной визуализации, эта функция является еще более заметным с носовой и височной стороны глаза разделены SOS, который хорошо виден как линия в спинном глазу. К 28 часам после оплодотворения в диком типе зебры, окрашивание ламинина ясно демонстрирует, что SOS полностью закрыта, что делает это идеальным этапом для мониторинга задержек в закрытии трещины. Инъекция расширенной GFP-CAX mRNA позволяет визуализировать клеточные мембраны живого или фиксированного эмбриона для отслеживания изменений в морфологии клеток, которые приводят к закрытию SOS.
Визуализация SOS может быть трудной, так как она узкая и преходящая. Тем не менее, крайне важно, чтобы вы поддерживаете последовательный метод скоринга при оценке задержек закрытия в более поздних точках времени. Эти методы могут сочетаться с экспериментальными манипуляциями для выявления генетических факторов или фармакологических агентов, которые влияют на надлежащее образование и закрытие SOS.
