Este conjunto de protocolos estandarizados se puede utilizar para ofrecer una nueva visión del sulcus ocular superior, o SOS, una estructura recientemente descubierta del ojo en desarrollo. Estos protocolos permitirán a cualquier experimentador de todo el mundo visualizar claramente el SOS durante el desarrollo del ojo de pez cebra. Comience colocando el factor de diferenciación del crecimiento heterocigoto seis Un pez cebra macho y hembra en lados separados de un divisor en un tanque de agua de clorada la noche antes de su emparejamiento.
A la mañana siguiente, retire el divisor y deje que el pez se reproduzca durante no más de 30 minutos. Al final del período de cría, recoger los embriones en platos Petri que contienen E3 medio para su incubación en una incubadora de 28,5 grados. A las 20 horas después de la fertilización, reemplace el sobrenadante por un medio E3 complementado 0,004%1-fenil-2-tórico para prevenir la producción de pigmentos y examine los embriones mediante microscopía de luz para confirmar que todos están en la etapa de desarrollo adecuada.
Coloque las muestras bajo un microscopio de disección. Deseche los embriones inmaduros del desarrollo y use fórceps finos para separar suavemente las coros. Visualice el SOS, que puede aparecer como una sangría o línea en el margen dorsal del ojo.
A continuación, ordene los embriones que muestran el retardo de cierre de SOS de los que no lo hacen. Para fotografiar estos embriones con un microscopio diseccionado, prepare un plato de Petri que contenga 1% de agarosa en medio E3 y pinche ligeramente el centro de la agarosa para crear un agujero poco profundo en el que se pueda colocar la yema del embrión. A continuación, coloque un embrión anestesiado lateralmente sobre la agarosa.
Para imaginar los embriones utilizando un microscopio compuesto o confocal, transfiera un embrión a un plato Petri de 35 milímetros que contenga un pequeño bolo de 1% de agarizado 1% bajo no gelizado en el medio E3 y utilice una línea de pesca fina para colocar rápidamente el embrión en la posición lateral. Cuando la agarosa se haya enfriado, vierta suficiente medio E3 en el plato para cubrir la agarosa y utilice una lente objetivo de inmersión en agua de 20x para visualizar el SOS. Después de la toma de imágenes, tire suavemente de la agarosa del embrión y fije el tejido en 4%paraformaldehído o permita que el pez cebra continúe su desarrollo.
Para visualizar el SOS mediante la expresión de ARNm fluorescente, utilice un aparato de microinyección para inyectar 300 picogramas de ARNm GFP-CAX mejorado en embriones en la etapa de una célula. A continuación, utilice un estereoscopio fluorescente para detectar embriones con una expresión de GFP mejorada brillante y obtener imágenes de los embriones mediante uno de los métodos de diagnóstico por imágenes como se ha demostrado. Para la tinción inmunofluorescente de montaje integral de laminin de peces cebra embrionarios, descorciar los embriones como se ha demostrado y fijar los embriones en un tubo de microcentrífuga en 4%paraformaldehído recién preparado durante dos horas en un agitador de temperatura ambiente.
Al final de la fijación, lave los embriones cuatro veces en PBS más Tween, o PBST, durante cinco minutos por lavado seguido de permeabilización en 10 microgramos por mililitro o Proteinasa K a temperatura ambiente durante cinco minutos. Lavar los embriones permeabilizados cuatro veces en PBST como se ha demostrado y bloquear los embriones en 5%suero de cabra y dos miligramos por mililitro de albúmina sérica bovina en PBST durante una a dos horas en un agitador de temperatura ambiente. Al final de la incubación de bloqueo, incubar los embriones en el anticuerpo antilaminin primario de interés a cuatro grados centígrados durante la noche en un agitador.
A la mañana siguiente, lave los embriones cinco veces en PBST durante 15 minutos por lavado y etiquete los tejidos con un anticuerpo secundario apropiado durante la noche a cuatro grados centígrados en el agitador protegido de la luz. A la mañana siguiente, lave los embriones cuatro veces en PBST durante 15 minutos por lavado y coloque los embriones en un pequeño plato de Petri que contenga PBST fresco. Usando fórceps finos, interrumpa suavemente las yemas y retire las células de la yema a través de un raspado suave de los sacos de yema.
Transfiera los embriones desyolked a 30% de glicerol recién preparado en PBS, asegurándose de colocar los embriones encima de la solución y transfiriendo la menor solución anterior posible y esperando a que los embriones se hundan hasta el fondo del tubo. Cuando los embriones hayan llegado al fondo del recipiente, transfiéralos al 50% secuencial y al 70% de glicerol en soluciones PBS, como acabamos de demostrar. Después de que los embriones se hayan hundido en la parte inferior del recipiente del 70% de glicerol, transfiera las muestras a un pequeño plato plástico para disecciones y cortar los embriones posteriores a los cerebros traseros.
Usando herramientas de disección fina, mueva una cabeza a un portaobjetos de vidrio con el menor glicerol posible e inserte suavemente un pasador de minutien fino en el ventrículo del antebrain del interior, empujando hacia abajo para separar las mitades derecha e izquierda de la cabeza entre sí. Cuando la cabeza se haya alineado completamente por la línea media, monte cada lado de la línea media de la cabeza hacia abajo, del lado del ojo hacia arriba. El SOS es observable a través del microscopio diseccionador a las 20 a 23 horas después de la fertilización y a través de imágenes de contraste de interferencia diferencial como una línea delgada en el ojo dorsal que separa las mitades nasal y temporal de la retina en desarrollo.
Además, una lendición sutil puede ser visible en el límite dorsal del ojo. Después de la tinción inmunofluorescente de la laminin, la línea delgada se puede confirmar como la membrana del sótano. Cuando el cierre del SOS se retrasa, su presencia prolongada se puede observar como una hendidura pronunciada en el lado dorsal del ojo bajo un microscopio diseccionado.
Cuando se observa bajo un microscopio compuesto utilizando imágenes de contraste de interferencia diferencial, esta característica es aún más prominente con los lados nasales y temporales del ojo separados por el SOS, que es claramente visible como una línea en el ojo dorsal. Por 28 horas después de la fertilización en el pez cebra tipo salvaje, la tinción de laminin demuestra claramente que el SOS está completamente cerrado, lo que lo convierte en la etapa ideal para el seguimiento de los retrasos en el cierre de la fisura. La inyección de mRNA GFP-CAX mejorada permite la visualización de las membranas celulares del embrión vivo o fijo para el seguimiento de los cambios en la morfología de las células que conducen al cierre del SOS.
Visualizar el SOS puede ser difícil, ya que es estrecho y transitorio. Sin embargo, es imperativo que mantenga un método de puntuación coherente al evaluar los retrasos de cierre en momentos posteriores. Estas técnicas se pueden combinar con manipulaciones experimentales para identificar factores genéticos o agentes farmacológicos que afectan a la formación y el cierre adecuados de SOS.
