金黄色葡萄球菌生物膜碱性磷酸酶活性的比色法分析

该协议提出了一种简单可靠的方法，用于测量S.aureus生物膜培养物中的碱化磷酸酶活性。这将有助于我们了解ALP在生物膜形成中的功能。这种技术的主要优点是高吞吐量。

它非常敏感，易于执行。演示这个程序的将是凯文·达尼科夫斯基，一个前哈珀学院的学生。要准备TSB，在蒸馏水中加入甲壳素胰腺消化、大豆粉的木瓜消化、氯化钠、葡萄糖和磷酸二钾。

用铝箔盖住烧瓶，并放入自给器中，在使用前进行消毒。要准备 TSA，请将 agar 添加到 TSB 中，并将其放入自动保护器中进行灭菌。然后让它冷却到室温。

接下来，以每盘20毫升的比例倒入培养皿中。要准备生物膜培养介质，在自动杀菌TSB中加入葡萄糖，达到每升10克的浓度。使用真空过滤套件，使用 0.2 微米孔径过滤器过滤溶液。

要接种，使用灭菌接种循环从培养皿中挑选一个葡萄球菌葡萄球菌的单个菌落，并放在装满10毫升TSB的培养管中。将管子放入孵化器中，在37摄氏度下过夜生长。使用微管，绘制 100 微升的隔夜培养液，并转移到充满 10 毫升 TSB 的培养管中，用葡萄糖稀释 1:100 体积比。

轻轻的涡流混合，获得一致的浓度。使用微管将200微升稀释培养液从一个96孔板中输送到总共18口井中。在37摄氏度下孵育96井板，24小时进行生物膜形成。

对于S.aureus的最佳生物膜形成，最好选择一个平底或圆形底部96井板。之后，稍微倾斜板，通过从每一个井的边缘的吸气来抽取上经剂。用 1X PBS 清洗每个井。

将板放入离心机中，以每分钟8000转的速度旋转5分钟，然后通过吸气将上一代液。将 75 微升缓冲 ALP 基板（由市售 PNPP 组成）添加到每一井中，并使用计时器记录三分球的每个时间点。在每个孵化时间点后，在三口井中每口加入75微升5个氢摩尔钠，以停止反应。

以每分钟 800 转的速度将板离心五分钟。使用移液器将 100 微升的上流液转移到新的 96 井板中，用于热量测量。使用 96 井板读取器测量每一个井在 405 纳米的吸光度。

使用 30 分钟的时间点井来控制背景噪音。在三个 96 孔板中重复整个实验。该协议开发一种快速可靠的检测方法，以测量S.aureus生物膜中不需要蛋白质分离的ALP活性。

ALP 活动的代表性结果显示，其上升趋势长达 75 分钟。75 分钟后，未观察到 ALP 活性增加。建立良好的生物膜文化是非常重要的，可能需要相当多的试验才能掌握。

您可以通过执行我们和其他人先前报告的水晶紫罗兰测定来确认生物膜的形成，或者您可以使用人类血浆对板进行预处理，以方便生物膜的形成。开发后，您可以筛选可能干扰生物膜形成的潜在ALP抑制剂。这一结果将为医学领域的生物膜管理提供重要的信息。

五摩尔氢氧化钠在接触时可能很危险。处理时一定要穿戴个人防护装备。