ערכי צבע מוחלטים ניתוח אלקליין פוספטאז פעילות ב- S. aureus Biofilm

פרוטוקול זה הציג שיטה קלה ואמינה למדידת פעילות פוספטזה אלקלים בתרבות הביופילם של S.aureus. זה יעזור לנו להבין את הפונקציה של ALP בהיווצרות ביופילם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא תפוקה גבוהה.

זה מאוד רגיש וקל לביצוע. הפגנת ההליך תהיה קווין דניקובסקי, סטודנט לשעבר ממג' הארפר. כדי להכין TSB, להוסיף תקציר הלבלב של קזין, עיכול פפאי של ארוחת סויה, נתרן כלורי, דקסטרוז, דיפוטאסיום פוספט לתוך מים מזוקקים.

מכסים את הבקבוק בנייר אלומיניום ומכניסים אותו לתקלה אוטומטית כדי לעקר לפני השימוש. כדי להכין TSA, להוסיף אגר TSB ולשים אותו autoclave עבור עיקור. ואז לתת לו להתקרר לטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, יוצקים אותו לתוך צלחת פטרי ביחס של 20 מיליליטר למנה. כדי להכין מדיום תרבות ביופילם, להוסיף גלוקוז TSB autoclaved כדי להשיג את הריכוז של 10 גרם לליטר. בעזרת ערכת סינון ואקום, מסננים את הפתרון באמצעות מסנן בגודל נקבוביות בגודל 0.2 מיקרומטר.

כדי לחסן, להשתמש בלולאת חיסון מעוקרת כדי לבחור מושבה בודדת אחת של Aureus Staph מצלחת פטרי ולמקם אותו בצינור התרבות מלא 10 מיליליטר של TSB. שים את הצינור באינקובטור לגדול לילה ב 37 מעלות צלזיוס. עם micropipette, לצייר 100 microliters של תרבות הלילה ולהעביר אותו צינור תרבות מלא 10 מיליליטר של TSB עם גלוקוז עבור דילול יחס נפח 1:100.

מערבולת בעדינות לערבב לריכוז עקבי. השתמש micropipette להעביר 200 microliters של תרבות מדוללת לתוך סך של 18 בארות מצלחת אחת 96 באר. דגירה צלחת 96 גם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות עבור היווצרות ביופילם.

עבור היווצרות biofilm הטוב ביותר של S.aureus, עדיף לבחור שטוח או עגול התחתון 96 צלחת היטב. לאחר מכן, להטות מעט את הצלחת כדי decant supernatant על ידי שאיפה מקצה כל באר. לשטוף כל באר עם 1X PBS.

שים את הצלחת בצנטריפוגה להסתובב במשך חמש דקות ב 8, 000 מהפכות לדקה ולפענח את העל טבעי על ידי שאיפה. הוסף 75 מיקרוליטרים של מצע ALP במאגר המורכב PNPP זמין מסחרית לכל באר ולהשתמש טיימר כדי להקליט כל נקודת זמן ב- triplicate. לאחר כל נקודת זמן דגירה, להוסיף 75 microliters של חמישה נתרן הידרוקסיד טוחן לכל אחת משלוש בארות כדי לעצור את התגובה.

צנטריפוגה הצלחת במשך חמש דקות ב 800 מהפכות לדקה. השתמש פיפטה להעביר 100 microliters של על טבעי לתוך צלחת באר 96 חדש למדידה קלורימטרית. השתמש בקורא 96 צלחות היטב כדי למדוד את הספיגה של כל באר ב 405 ננומטר.

השתמשו בארות נקודת הזמן של 30 דקות כדי לשלוט ברעשי רקע. חזור על הניסוי כולו בשלוש 96 צלחות באר. פרוטוקול זה מפתחת תדהמה מהירה ואמינה למדידת פעילות ALP בביופילם S.aureus שאינו דורש בידוד חלבונים.

התוצאה הייצוגית של פעילות ALP מראה מגמה מוגברת של עד 75 דקות. לאחר 75 דקות, לא נצפתה עלייה בפעילות ALP. חשוב מאוד להקים תרבות ביופילם טובה וזה עלול לקחת לא מעט ניסויים כדי לשלוט.

אתה יכול לאשר היווצרות ביופילם על ידי ביצוע בדיקת קריסטל סגול כפי שדווח בעבר על ידינו ואחרים או שאתה יכול מראש לטפל בצלחת עם פלזמה אנושית כדי להקל על היווצרות ביופילם. לאחר התפתחותו, אתה יכול לסנן מעכבי ALP פוטנציאליים שעלולים להפריע היווצרות biofilm. התוצאה תספק מידע חשוב לניהול ביופילם בתחום הרפואי.

חמישה נתרן הידרוקסיד דיוח עלול להיות מסוכן במקרה של מגע. הקפד ללבוש ציוד מגן אישי בעת הטיפול.