Este protocolo presentaba un método fácil y fiable para medir la actividad de fosfatasa alcalinizada en el cultivo de biopelícula S.aureus. Nos ayudará a entender la función de LA ALP en la formación de biopelículas. La principal ventaja de esta técnica es el alto rendimiento.
Es muy sensible y fácil de realizar. Demostrando el procedimiento estará Kevin Danikowski, un ex estudiante del Harper College. Para preparar TSB, agregue el digerido pancreático de caseína, el digerido papaico de la harina de soja, el cloruro de sodio, la dextrosa y el fosfato de dipotassio en agua destilada.
Cubra el matraz con papel de aluminio y colótelo en un autoclave para esterilizarlo antes de usarlo. Para preparar una TSA, agregue el agar a TSB y colótelo en el autoclave para su esterilización. Luego déjelo enfriar a temperatura ambiente.
A continuación, vierta en el plato de Petri en una proporción de 20 mililitros por plato. Para preparar un medio de cultivo de biopelícula, añadir glucosa a TSB autoclavado para lograr la concentración de 10 gramos por litro. Con un kit de filtración al vacío, filtre la solución con un filtro de 0,2 micrómetros de tamaño de poro.
Para inocular, utilice un bucle de inoculación esterilizado para recoger una colonia individual de Staph aureus de la placa Petri y colóquela en el tubo de cultivo lleno de 10 mililitros de TSB. Ponga el tubo en la incubadora para crecer durante la noche a 37 grados centígrados. Con una micropipeta, extraiga 100 microlitros de cultivo nocturno y transfiéralo a un tubo de cultivo lleno de 10 mililitros de TSB con glucosa para una dilución de la relación de volumen de 1:100.
Vórtice suavemente para mezclar para una concentración constante. Utilice una micropipeta para transferir 200 microlitros de cultivo diluido a un total de 18 pozos de una placa de 96 pozos. Incubar la placa de 96 pozos a 37 grados Centígrados durante 24 horas para la formación de biopelículas.
Para la mejor formación de biopelícula de S.aureus, es mejor elegir una placa plana o redonda inferior de 96 pozos. Después de eso, incline ligeramente la placa para decantar el sobrenadante por aspiración desde el borde de cada pozo. Lave cada pozo con 1X PBS.
Ponga el plato en la centrífuga para girar durante cinco minutos a 8.000 revoluciones por minuto y decantar el sobrenadante por aspiración. Añadir 75 microlitros de sustrato ALP tamponado que consiste en PNPP disponible comercialmente a cada pozo y utilizar un temporizador para registrar cada punto de tiempo en triplicado. Después de cada punto de tiempo de incubación, agregue 75 microlitros de cinco molares de hidróxido de sodio a cada uno de los tres pozos para detener la reacción.
Centrifugar la placa durante cinco minutos a 800 revoluciones por minuto. Utilice una pipeta para transferir 100 microlitros de sobrenadante a una nueva placa de 96 pozos para la medición calorimétrica. Utilice un lector de placas de 96 pozos para medir la absorbancia de cada pozo a 405 nanómetros.
Utilice los pozos de punto de tiempo de 30 minutos para controlar el ruido de fondo. Repita todo el experimento en tres placas de 96 pozos. Este protocolo desarrolla un ensayo rápido y fiable para medir la actividad de ALP en biopelícula S.aureus que no requiere aislamiento proteico.
El resultado representativo de la actividad de ALP muestra una tendencia creciente de hasta 75 minutos. Después de 75 minutos, no se observó ningún aumento de la actividad de ALP. Es muy importante establecer un buen cultivo de biopelícula y puede tomar bastantes ensayos para dominar.
Puede confirmar la formación de biopelículas realizando ensayos de cristal violeta como ya informamos nosotros y otros o puede pretratar la placa con plasma humano para facilitar la formación de biopelículas. Después de su desarrollo, puede detectar posibles inhibidores de la ALP que podrían interferir en la formación de biopelículas. El resultado proporcionará información importante para el manejo de biopelículas en el campo médico.
Cinco molares de hidróxido de sodio pueden ser peligrosos en caso de contacto. Asegúrese de usar equipo de protección personal al manipular.
