Este protocolo apresentou um método fácil e confiável para medir a atividade fosfattase alcaalizada na cultura biofilme S.aureus. Isso nos ajudará a entender a função da ALP na formação de biofilmes. A maior vantagem dessa técnica é o alto rendimento.
É muito sensível e fácil de realizar. Demonstrando o procedimento estará Kevin Danikowski, um ex-aluno da Harper College. Para preparar a TSB, adicione o digestor pancreático da caseína, o digestão papaic da farelo de soja, cloreto de sódio, dextrose e fosfato de dipotassium em água destilada.
Cubra o frasco com papel alumínio e coloque-o em uma autoclave para esterilizar antes de usar. Para preparar um TSA, adicione ágar ao TSB e coloque-o na autoclave para esterilização. Então deixe esfriar até a temperatura ambiente.
Em seguida, despeje-o na placa de Petri a uma proporção de 20 mililitros por prato. Para preparar um meio de cultura de biofilme, adicione glicose ao TSB autoclavado para alcançar a concentração de 10 gramas por litro. Usando um kit de filtragem de vácuo, filtrar a solução com um filtro de tamanho de poro de 0,2 micômetro.
Para inocular, use um laço de inoculação esterilizado para escolher uma colônia individual de Staph aureus da placa de Petri e colocá-la no tubo de cultura preenchido com 10 mililitros de TSB. Coloque o tubo na incubadora para crescer durante a noite a 37 graus Celsius. Com uma micropipette, desenhe 100 microliters de cultura durante a noite e transfira-o para um tubo de cultura cheio de 10 mililitros de TSB com glicose para uma diluição de proporção de volume de 1:100.
Vórtice suavemente para misturar para uma concentração consistente. Use uma micropipette para transferir 200 microliters de cultura diluída em um total de 18 poços de uma placa de poço de 96. Incubar a placa de 96 poços a 37 graus Celsius durante 24 horas para formação de biofilme.
Para a melhor formação de biofilme de S.aureus, é melhor escolher uma placa de fundo 96 plana ou redonda. Depois disso, incline ligeiramente a placa para decantar o sobrenante por aspiração da borda de cada poço. Lave cada poço com 1X PBS.
Coloque a placa na centrífuga para girar por cinco minutos a 8.000 revoluções por minuto e decante o supernatante por aspiração. Adicione 75 microliters de substrato ALP tamponado que consiste em PNPP comercialmente disponível para cada poço e use um temporizador para registrar cada ponto de tempo em triplicado. Após cada ponto de tempo de incubação, adicione 75 microlitadores de cinco hidróxido de sódio molar a cada um dos três poços para parar a reação.
Centrifugar a placa por cinco minutos a 800 revoluções por minuto. Use uma pipeta para transferir 100 microliters de supernascer em uma nova placa de poço 96 para medição calórica. Use um leitor de placas de 96 poços para medir a absorção de cada poço em 405 nanômetros.
Use os poços de ponto de tempo de 30 minutos para controlar o ruído de fundo. Repita todo o experimento em três placas de 96 poços. Este protocolo desenvolve um ensaio rápido e confiável para medir a atividade da ALP no biofilme S.aureus que não requer isolamento de proteínas.
O resultado representativo da atividade da ALP mostra uma tendência crescente de até 75 minutos. Após 75 minutos, não foi observado aumento da atividade da ALP. É muito importante estabelecer uma boa cultura de biofilm e pode levar alguns testes para dominar.
Você pode confirmar a formação de biofilmes realizando ensaios violeta cristalinas como relatado anteriormente por nós e outros ou você pode pré-tratar a placa com plasma humano para facilitar a formação de biofilm. Após seu desenvolvimento, você pode rastrear potenciais inibidores de ALP que podem interferir na formação de biofilmes. O resultado fornecerá informações importantes para o gerenciamento de biofilmes na área médica.
Cinco hidróxido de sódio molar podem ser perigosos em caso de contato. Certifique-se de usar equipamento de proteção individual durante o manuseio.
