Questo protocollo ha presentato un metodo facile e affidabile per misurare l'attività della fosfatasi alcalinizzata nella cultura del biofilm S.aureus. Ci aiuterà a comprendere la funzione di ALP nella formazione di biofilm. Il principale vantaggio di questa tecnica è l'elevata produttività.
È molto sensibile e facile da eseguire. A dimostrare la procedura sarà Kevin Danikowski, ex studente dell'Harper College. Per preparare il TSB, aggiungere il digerimento pancreatico della caseina, il digestione papaica della farina di soia, il cloruro di sodio, il destrosio e il fosfato di dipotassio in acqua distillata.
Coprire il pallone con un foglio di alluminio e metterlo in autoclave per sterilizzare prima dell'uso. Per preparare una TSA, aggiungere l'agar al TSB e metterlo in autoclave per la sterilizzazione. Quindi lascialo raffreddare a temperatura ambiente.
Quindi, versalo nella piastra di Petri con un rapporto di 20 millilitri per piatto. Per preparare un mezzo di coltura di biofilm, aggiungere glucosio al TSB autoclavato per ottenere la concentrazione di 10 grammi per litro. Utilizzando un kit di filtrazione sottovuoto, filtrare la soluzione con un filtro delle dimensioni di un poro di 0,2 micrometri.
Per inoculare, utilizzare un circuito di inoculazione sterilizzato per scegliere una singola colonia di Staph aureus dalla piastra di Petri e posizionarlo nel tubo di coltura riempito con 10 millilitri di TSB. Metti il tubo nell'incubatrice per crescere durante la notte a 37 gradi Celsius. Con una micropipetta, disegnare 100 microlitri di coltura notturna e trasferirli in un tubo di coltura riempito con 10 millilitri di TSB con glucosio per una diluizione del rapporto volume 1:100.
Vortice delicatamente da mescolare per una concentrazione costante. Utilizzare una micropipetta per trasferire 200 microlitri di coltura diluita in un totale di 18 pozzali da una piastra da 96 pozzi. Incubare la piastra del pozzo 96 a 37 gradi Celsius per 24 ore per la formazione di biofilm.
Per la migliore formazione di biofilm di S.aureus, è meglio scegliere una piastra piatta o rotonda del fondo 96. Successivamente, inclinare leggermente la piastra per decantare il supernatante per aspirazione dal bordo di ogni pozzo. Lavare ogni bene con 1X PBS.
Mettere la piastra nella centrifuga per girare per cinque minuti a 8.000 giri al minuto e decantare il supernatante per aspirazione. Aggiungere 75 microlitri di substrato ALP tamponato costituito da PNPP disponibile in commercio a ciascun pozzo e utilizzare un timer per registrare ogni punto di tempo in triplice copia. Dopo ogni punto di incubazione, aggiungere 75 microlitri di cinque idrossido di sodio molare a ciascuno dei tre pozzi per fermare la reazione.
Centrifuga la piastra per cinque minuti a 800 giri al minuto. Utilizzare una pipetta per trasferire 100 microlitri di supernatante in una nuova piastra di pozzo 96 per la misurazione calorimetrica. Utilizzare un lettore di piastre a 96 po porsi per misurare l'assorbanza di ogni pozzo a 405 nanometri.
Utilizzare i pozzi del punto di tempo di 30 minuti per controllare il rumore di fondo. Ripetere l'intero esperimento in tre piastre di pozzo 96. Questo protocollo sviluppa un saggio rapido e affidabile per misurare l'attività alp nel biofilm S.aureus che non richiede isolamento proteico.
Il risultato rappresentativo dell'attività ALP mostra una tendenza aumentata fino a 75 minuti. Dopo 75 minuti, non è stato osservato alcun aumento dell'attività alp. È molto importante stabilire una buona cultura del biofilm e potrebbero essere necessarie alcune prove da padroneggiare.
Puoi confermare la formazione di biofilm eseguendo un saggio di viola cristallo come precedentemente riportato da noi e da altri o puoi pre-trattare la piastra con plasma umano per facilitare la formazione di biofilm. Dopo il suo sviluppo, è possibile schermare potenziali inibitori dell'ALP che potrebbero interferire nella formazione di biofilm. Il risultato fornirà importanti informazioni per la gestione del biofilm in campo medico.
Cinque idrossido di sodio molare potrebbero essere pericolosi in caso di contatto. Assicurarsi di indossare dispositivi di protezione individuale durante la manipolazione.
